吳 源 高 鵬 李海濤 （青海紅十字醫(yī)院口腔科，西寧810000）

牙周病是常見的口腔疾病，人牙周膜細胞（hu?man periodontal ligament cells，hPDLCs）是牙周結締組織中重要的間質細胞，在牙周組織的增殖中起重要作用，hPDLCs損傷可分泌多種細胞因子影響牙周病的發(fā)生；而脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是公認的炎癥啟動因子［1-2］。哈巴苷是玄參中的主要成分，具有抗氧化及保護細胞免受損傷的作用，如哈巴苷能通過抑制氧化應激抑制心肌細胞H9c2 凋亡［3］。哈巴苷可通過激活 Wnt/β-catenin 信號傳導途徑來減輕大鼠脊髓損傷后神經元凋亡并促進軸突再生［4］。哈巴苷可通過激活PI3K/Akt信號通路改善 Aβ25-35 誘導的 PC12 細胞毒性［5］。然而哈巴苷對hPDLCs 損傷的影響及機制尚不清楚。研究報道m(xù)iR-1246 過表達加劇了LPS 誘導的軟骨細胞活力下降，細胞凋亡增加和促炎因子的過度產生［6］。miR-1246 在LPS 誘導的肺動脈內皮細胞損傷中高表達，干擾其表達可抑制LPS 誘導的細胞凋亡和炎癥因子 IL-1β 和 TNF-α 的釋放［7］。但 miR-1246 對LPS誘導hPDLCs損傷的影響，以及哈巴苷是否通過調控miR-1246 的表達影響LPS 誘導的hPDLCs 損傷目前還尚未可知。因此，本實驗旨在研究哈巴苷是否通過調控miR-1246 的表達影響LPS 誘導的hP?DLCs損傷。

1 材料與方法

1.1 材料 hPDLCs（貨號：RC-CELL-0185，上海諾辰生物技術有限公司）；DMEM 培養(yǎng)液（貨號：319-005-CL，北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司）；哈巴苷（貨號：111728，上海雅吉生物科技有限公司）；脂多糖（貨號：L2880，美國Sigma 公司）；TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（貨號：E-EL-H0109c，武漢巴菲爾生物技術服務有限公司）、IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（貨號：E-EL-H0149c，武漢巴菲爾生物技術服務有限公司）；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（貨號：P-CA-201，武漢益普生物科技有限公司）；RIPA蛋白裂解液（貨號：QCB-3201-1，上海欽誠生物科技有限公司）；BCA 試劑盒（貨號：23227，北京諾博萊德科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞處理與分組 hPDLCs用含20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，取第3代細胞，用10 μg/ml LPS 處理作為 LPS 組，分別用濃度為 20 μmo/l L、40 μmo/l L、80 μmo/l L 的哈巴苷和 10 μg/ml LPS 處理，作為哈巴苷低、中、高濃度組，不做處理的為Con組；將 anti-miR-NC、anti-miR-1246 轉染至 hPDLCs 后用 10 μg/ml LPS 處理，記為 LPS+anti-miR-NC 組、LPS+anti-miR-1246 組 ；miR-NC、miR-1246 轉 染 至hPDLCs后用80 μmo/l L的哈巴苷和10 μg/ml LPS處理，記為LPS+HG+miR-NC組、LPS+HG+miR-1246組。

1.2.2 ELISA 檢測TNF-α、IL-1β 水平 取1.2.1各組細胞培養(yǎng)上清，具體按照試劑盒操作進行檢測。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 取各組細胞，洗滌后用結合緩沖液重懸，加入10 μl 的Annexin V-FITC 和5 μl 的PI，混勻，避光孵育 10 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 Western blot 檢測蛋白表達 用RIPA 蛋白裂解液提取細胞總蛋白，再用BCA 試劑盒進行定量。蛋白樣品變性后進行SDS-PAGE，轉至PVDF上，脫脂牛奶封閉后加入相應的一抗，4℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，加入電化學發(fā)光液顯影，定影成像后分析蛋白條帶灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平。

1.2.5 RT-qPCR 檢測miR-1246 表達水平 提取細胞總 RNA，反轉錄成 cDNA，miR-1246 以U6 為內參進行 PCR 擴增，相對表達量用 2-ΔΔCt法計算。miR-1246 上游引物序列：5'-AATGGATTTTTGGAGCAGG-3'，下游引物序列：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6 上游引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCA?CA-3'，下游引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTT?GCGT-3'。

1.3 統(tǒng)計學分析 用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料用表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 哈巴苷對LPS誘導的hPDLCs炎癥因子表達的影響 與 Con 組比較，LPS 組 hPDLCs 中 TNF-α、IL-1β 水平升高（P<0.05）；與 LPS 組比較，哈巴苷低、中、高濃度組hPDLCs中TNF-α、IL-1β水平降低，且呈濃度依賴性（P<0.05，表1）。

表1 哈巴苷對LPS 誘導的hPDLCs 炎癥因子表達的影響（，ng/ml，n=9）Tab.1 Effect of harpagide on expression of inflammatory factors in human periodontal ligament cells in?duced by LPS（，ng/ml，n=9）

表1 哈巴苷對LPS 誘導的hPDLCs 炎癥因子表達的影響（，ng/ml，n=9）Tab.1 Effect of harpagide on expression of inflammatory factors in human periodontal ligament cells in?duced by LPS（，ng/ml，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05；compared with LPS+HG-L group，3）P<0.05；com?pared with LPS+HG-M group，4）P<0.05.

IL-1β 2.39±0.22 13.19±1.071）9.69±0.862）6.32±0.512）3）3.33±0.232）3）4）404.409 0.000 Groups Con LPS LPS+HG-L LPS+HG-M LPS+HG-H F P TNF-α 4.22±0.37 9.88±0.621）7.88±0.482）6.23±0.282）3）5.04±0.232）3）4）262.702 0.000

2.2 哈巴苷對LPS誘導的hPDLCs凋亡的影響 與Con 組比較，LPS 組 hPDLCs 凋亡率升高，Bcl-2 表達水平降低，Bax 表達水平升高（P<0.05）；與LPS 組比較，哈巴苷低、中、高濃度組hPDLCs凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax 表達水平降低，且呈濃度依賴性（P<0.05，圖1、表2）。

表2 哈巴苷對LPS誘導的hPDLCs凋亡的影響（，n=9）Tab.2 Effect of harpagide on LPS-induced apoptosis of hPDLCs（，n=9）

表2 哈巴苷對LPS誘導的hPDLCs凋亡的影響（，n=9）Tab.2 Effect of harpagide on LPS-induced apoptosis of hPDLCs（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05；compared with LPS+HG-L group，3）P<0.05；com?pared with LPS+HG-M group，4）P<0.05.

Bax protein 0.28±0.02 0.74±0.051）0.61±0.052）0.47±0.032）3）0.34±0.032）3）4）224.823 0.000 Groups Con LPS LPS+HG-L LPS+HG-M LPS+HG-H F P Apoptosis rate（%）6.17±0.57 26.82±2.191）20.01±1.582）16.05±1.312）3）9.52±0.612）3）4）314.546 0.000 Bcl-2 protein 0.62±0.04 0.12±0.021）0.25±0.022）0.37±0.032）3）0.53±0.042）3）4）378.092 0.000

圖1 哈巴苷對LPS誘導的hPDLCs凋亡的影響Fig.1 Effect of harpagide on LPS-induced apoptosis of hPDLCs

2.3 哈巴苷對LPS 誘導的hPDLCs 中miR-1246 表達的影響 與Con 組比較，LPS 組miR-1246 表達水平升高（P<0.05）；與LPS 組比較，哈巴苷低、中、高濃度組miR-1246 表達水平降低，且呈濃度依賴性（P<0.05，表3）。

表3 哈巴苷對LPS 誘導的hPDLCs 中miR-1246 表達的影響（，n=9）Tab.3 Effect of harpagide on expression of miR-1246 in hPDLCs induced by LPS（，n=9）

表3 哈巴苷對LPS 誘導的hPDLCs 中miR-1246 表達的影響（，n=9）Tab.3 Effect of harpagide on expression of miR-1246 in hPDLCs induced by LPS（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05；compared with LPS+HG-L group，3）P<0.05；com?pared with LPS+HG-M group，4）P<0.05.

miR-1246 1.00±0.07 3.22±0.271）2.48±0.212）1.89±0.162）3）1.38±0.132）3）4）213.170 0.000 Groups Con LPS LPS+HG-L LPS+HG-M LPS+HG-H F P

2.4 抑制 miR-1246 表達對 LPS 誘導的 hPDLCs 炎癥因子表達的影響 與LPS+anti-miR-NC 組比較，LPS+anti-miR-1246 組 miR-1246 表達水平及 TNF-α、IL-1β水平降低（P<0.05，表4）。

表4 抑制miR-1246 表達對LPS 誘導的hPDLCs 炎癥因子表達的影響（，n=9）Tab.4 Effect of inhibiting expression of miR-1246 on ex?pression of inflammatory factors in hPDLCs in?duced by LPS（，n=9）

表4 抑制miR-1246 表達對LPS 誘導的hPDLCs 炎癥因子表達的影響（，n=9）Tab.4 Effect of inhibiting expression of miR-1246 on ex?pression of inflammatory factors in hPDLCs in?duced by LPS（，n=9）

Note：Compared with LPS+anti-miR-NC group，1）P<0.05.

IL-1β（ng/ml）13.64±1.23 4.37±0.351）21.746 0.000 Groups LPS+anti-miR-NC LPS+anti-miR-1246 t P miR-1246 1.00±0.05 0.28±0.031）37.044 0.000 TNF-α（ng/ml）9.92±0.57 5.75±0.371）18.409 0.000

2.5 抑制 miR-1246 表達對 LPS 誘導的 hPDLCs 凋亡的影響 與LPS+anti-miR-NC 組比較，LPS+antimiR-1246 組細胞凋亡率降低，Bcl-2 表達水平升高，Bax表達水平降低（P<0.05，圖2、表5）。

表5 抑制miR-1246 表達對LPS 誘導的hPDLCs 凋亡的影響（，n=9）Tab.5 Effect of inhibiting expression of miR-1246 on apoptosis of hPDLCs induced by LPS（，n=9）

表5 抑制miR-1246 表達對LPS 誘導的hPDLCs 凋亡的影響（，n=9）Tab.5 Effect of inhibiting expression of miR-1246 on apoptosis of hPDLCs induced by LPS（，n=9）

Note：Compared with LPS+anti-miR-NC group，1）P<0.05.

Bax protein 0.75±0.05 0.42±0.041）15.461 0.000 Groups LPS+anti-miR-NC LPS+anti-miR-1246 t P Apoptosis rate（%）28.15±2.57 11.89±1.051）17.571 0.000 Bcl-2 protein 0.11±0.02 0.51±0.041）26.833 0.000

圖2 抑制miR-1246 表達對LPS 誘導的hPDLCs 凋亡的影響Fig.2 Effect of inhibiting expression of miR-1246 on apoptosis of hPDLCs induced by LPS

2.6 miR-1246 過表達逆轉了哈巴苷（80 μmol/L）對LPS 誘導的hPDLCs 損傷的作用 與LPS+HG+miR-NC 組比較，LPS+HG+miR-1246 組 miR-1246 及TNF-α、IL-1β 水平升高，細胞凋亡率升高，Bcl-2 表達水平降低，Bax表達水平升高（P<0.05，圖3、表6）。

表6 miR-1246過表達逆轉了哈巴苷對LPS誘導的hPDLCs損傷的作用（，n=9）Tab.6 Overexpression of miR-1246 reversed effect of harpagide on LPS-induced hPDLCs damage（，n=9）

表6 miR-1246過表達逆轉了哈巴苷對LPS誘導的hPDLCs損傷的作用（，n=9）Tab.6 Overexpression of miR-1246 reversed effect of harpagide on LPS-induced hPDLCs damage（，n=9）

Note：Compared with LPS+HG+miR-NC group，1）P<0.05.

Bax protein 0.32±0.02 0.64±0.041）21.466 0.000 Groups LPS+HG+miR-NC LPS+HG+miR-1246 t P miR-1246 1.00±0.06 2.38±0.211）18.956 0.000 TNF-α（ng/ml）4.66±0.36 8.24±0.561）16.133 0.000 IL-1β（ng/ml）3.19±0.22 9.71±0.511）35.216 0.000 Apoptosis rate（%）8.91±0.85 21.23±1.921）17.602 0.000 Bcl-2 protein 0.55±0.04 0.21±0.021）22.808 0.000

圖3 miR-1246 過表達逆轉了哈巴苷對LPS 誘導的hP?DLCs凋亡的作用Fig.3 Overexpression of miR-1246 reversed effect of harpagide on LPS-induced apoptosis of hPDLCs

3 討論

牙周病是一種牙周組織破壞的炎癥性疾病，而LPS 可引發(fā)牙周組織損傷，誘發(fā)炎癥因子的釋放從而導致牙周炎的發(fā)生［8-9］。因此，本實驗用LPS 處理hPDLCs，結果顯示，LPS 誘導的 hPDLCs 中 TNF-α、IL-1β 水平升高，細胞凋亡率升高，Bcl-2表達水平降低，Bax 表達水平升高；TNF-α、IL-1β 是促炎細胞因子，牙周炎中TNF-α、IL-1β 高表達［10］；表明LPS 可促進hPDLCs 中炎癥因子的釋放和細胞凋亡，誘導了hPDLCs 損傷。研究報道哈巴苷通過降低神經細胞凋亡，對急性腦缺血有保護作用［11］。哈巴苷可通過減少內質網(wǎng)應激來保護大鼠皮質神經元免受氧葡萄糖剝奪和復氧誘導的損傷［12］。為研究哈巴苷是否對hPDLCs 損傷有保護作用，本實驗采用不同濃度的哈巴苷處理LPS 誘導的hPDLCs，結果顯示，hP?DLCs 中 TNF-α、IL-1β 水平降低，細胞凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，且呈濃度依賴性；表明哈巴苷劑量依賴的抑制LPS誘導hPDLCs凋亡和炎癥因子的釋放，對LPS誘導的hPDLCs損傷具有保護作用，提示哈巴苷有發(fā)展成為新型牙周病治療藥物的潛能。

研究報道m(xù)iR-1246通過調節(jié)PKA和PP2A誘導間充質干/基質細胞的促炎反應［13］。lncRNA CAIF通過下調miR-1246 抑制LPS 誘導的骨關節(jié)炎CHON-001 細胞中 IL-6 上調［14］。lncRNA NEAT1 通過靶向miR-1246 誘導由NF-κB 介導的炎癥因子的分泌，從而促進角膜新生血管形成進程［15］。以上研究表明miR-1246 參與調控細胞炎癥因子的釋放。本實驗結果顯示LPS 誘導的hPDLCs 中miR-1246 表達水平升高，抑制 miR-1246 表達后，LPS 誘導的 hPDLCs 中TNF-α、IL-1β 水平降低，細胞凋亡率降低，Bcl-2 表達水平升高，Bax 表達水平降低，表明抑制miR-1246表達可抑制LPS 誘導的hPDLCs 凋亡和炎癥因子的釋放。此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)哈巴苷處理后的hPDLCs中miR-1246 表達水平降低；而miR-1246 過表達逆轉了哈巴苷對LPS 誘導的hPDLCs 損傷的作用。提示，哈巴苷可調控的miR-1246表達。

綜上所述，哈巴苷可通過抑制miR-1246 表達抑制LPS誘導的hPDLCs凋亡和炎癥因子的釋放，從而保護hPDLCs免受LPS誘導的損傷。