謝 陽(yáng) 袁正洲 劉夢(mèng)蘭 羅思維 李作孝 （西南醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，瀘州646000）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種通過(guò)免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）白質(zhì)的慢性炎性脫髓鞘為主要病變特點(diǎn)的疾病，它最常見的類型是復(fù)發(fā)緩解型（RR），該病的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，但MS 作為一種自身免疫性疾病主要依賴于淋巴T細(xì)胞介導(dǎo)的觀點(diǎn)已得到認(rèn)可，這些活化的T 細(xì)胞可直接進(jìn)入CNS 破壞髓鞘及神經(jīng)元軸突等重要結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致MS 的發(fā)生發(fā)展，而髓鞘堿性蛋白（MBP）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）作為神經(jīng)元損害及髓鞘脫失的特異性分泌因子在疾病的進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用［1-2］。而微小RNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，有部分研究提出中樞神經(jīng)系統(tǒng)的miRNAs 有潛在的免疫誘導(dǎo)作用，可以通過(guò)靶向效應(yīng)對(duì)免疫系統(tǒng)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子產(chǎn)生影響參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）等多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展［3］。這可能與高表達(dá)的miR-326 可以抑制靶基因產(chǎn)物Ets-1（一種調(diào)節(jié)Th17 分化的負(fù)性因子）的表達(dá)，T 淋巴細(xì)胞的活化，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的釋放損害髓鞘及神經(jīng)元等結(jié)構(gòu)，從而加重自身免疫性疾病患者病情有關(guān)［4］。但關(guān)于RRMS 患者miR-326 的表達(dá)情況與NSE、MBP的關(guān)系目前報(bào)道較少，所以本研究通過(guò)對(duì)RRMS 患者miR-326 水平的變化及其與NSE、MBP 之間的關(guān)系分析，探究miR-326 在RRMS 中的作用，并為MS的發(fā)病機(jī)制研究提供更多新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 收集西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2017 年8 月至2020 年4 月期間就診收治的復(fù)發(fā)緩解型MS 患者59 例（RRMS 診斷符合多發(fā)性硬化診斷與治療的中國(guó)專家共識(shí)［5］），其中RRMS 急性期組 33 例，男 10 例、女 23 例，年齡 21～58 歲，平均（35.47±6.23）歲；RRMS 緩解期組26 例，男8 例、女18 例，年齡 20～56 歲，平均（36.72±5.21）歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：①各組患者的臨床資料均完整；②已完善頭顱和全脊髓MRI 檢查；③各組患者均知情同意并簽署了知情同意書；④意識(shí)清晰，能完成配合研究者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重的心肺肝腎等臟器病變；②合并惡性腫瘤者；③有嚴(yán)重的感染和意識(shí)障礙而不能配合研究者；④有其他自身免疫性疾病者。

同步收集性別、年齡與RRMS 急性期和緩解期組相匹配的 30 例健康體檢者，男 10 例、女 20 例，年齡22～58 歲，平均（36.49±5.27）歲。所有的研究對(duì)象和家屬均簽署知情同意書，同時(shí)本臨床研究通過(guò)了西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑 ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司；Trizol LS 購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自中國(guó)TIANGEN 公司；miRNA 熒光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 血清樣本收集 所有受檢者在清晨抽取5 ml 靜脈血，在室溫中自然凝固15 min，4 000/rmin離心5 min，取出上層血清放在-80℃超低溫冰箱內(nèi)進(jìn)行存放，采用ELISA 法檢測(cè)各組外周血清中NSE、MBP的表達(dá)水平。

1.2.2 純化miRNA 和總RNA 將抽取的靜脈血從-80℃冰箱取出，F(xiàn)icoll 分離液將血漿進(jìn)行分層，具體操作如下：所取樣本融化后加入Trizol LS混勻并進(jìn)行振蕩，再將0.5 ml 氯仿加入混勻，低溫離心機(jī)10 000/rmin 離心10 min，取上清液并加用miRNeasy液，按miRNeasy 快速試劑盒說(shuō)明書的相關(guān)步驟提取總 miRNA。將提取的 miRNA 放入 30 μl 的 DEPC 水中56℃水浴15 min加速RNA的溶解。

1.2.3 RT-PCR 檢測(cè) 提純后的miRNA 使用MMLV 的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒完成第一鏈cDNA 合成，并使用miRNA 熒光檢測(cè)試劑盒，采用SYBR Green 嵌合熒光法的原理完成miRNA 熒光定量檢測(cè)。以上的操作過(guò)程均按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，反應(yīng)體系為 20 μl，引物設(shè)計(jì)使用 Primer 5.0 軟件完成，具體的引物序列為5'-CCUCUGGGCCCUUCCUCCAG-3'，定量PCR 的反應(yīng)條件為95℃ 下處理5 min，然后95℃變性10 s，再經(jīng)退火和延伸60℃36 s，重復(fù)進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。所有的數(shù)據(jù)使用ABI 7300 SDSvl. 2x System 軟件進(jìn)行處理，依靠軟件的自動(dòng)分析功能獲取相應(yīng)的Ct 值，將U6 作為內(nèi)參基因，外周血清中miR-326的相對(duì)含量差值為2-ΔΔCt，單樣品進(jìn)行3次的測(cè)定后軟件分析獲取出相應(yīng)Ct平均值。

1.2.4 外周血清中MBP、NSE 的檢測(cè) 按照ELISA試劑盒的具體操作說(shuō)明檢測(cè)各組外周血清MBP、NSE的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示，均數(shù)間的兩兩比較采用t檢驗(yàn)，并采用Pearson 檢驗(yàn)對(duì)變量間的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料的比較 各組患者在性別、年齡及合并基礎(chǔ)疾病的一般資料對(duì)比中均無(wú)明顯差異（P>0.05），見表1。

表1 各組一般資料的比較Tab.1 Comparison of general data for each group

2.2 各組外周血清中miR-326、NSE 及MBP 的水平表達(dá) 由表2 可以看出，無(wú)論在RRMS 的急性期組還是緩解期組，miR-326相對(duì)表達(dá)量和NSE、MBP的表達(dá)水平均顯著高于健康對(duì)照組（P均<0.05），而與緩解期組進(jìn)行比較，RRMS急性期組患者miR-326相對(duì)表達(dá)量及NSE、MBP的表達(dá)也都明顯增高（P均<0.05）。

表2 各組外周血清miR-326、NSE及MBP的表達(dá)情況（）Tab.2 Expression of miR-326，NSE and MBP in periph?eral blood of each group（）

表2 各組外周血清miR-326、NSE及MBP的表達(dá)情況（）Tab.2 Expression of miR-326，NSE and MBP in periph?eral blood of each group（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with RRMS remission group，2）P<0.05.

MBP（μg/ L）miR-326NSE（μg/ L）Groups Control（n=30）RRMS acute（n=33）RRMS remission（n=26）1.23±0.366.34±2.014.82±1.32 4.86±0.751）2）55.68±17.291）2）47.05±16.281）2）2.45±0.481）28.51±12.341）23.69±9.321）

2.3 RRMS 急性期及緩解期血清miR-326 水平與NSE、MBP的相關(guān)性分析 由表3可以看出：RRMS患者緩解期組外周血清中miR-326水平與NSE、MBP均呈正相關(guān)關(guān)系（r分別為0.742和0.693，P均<0.05），而急性組miR-326的相對(duì)表達(dá)量與NSE、MBP也呈正相關(guān)關(guān)系（r分別為0.821和0.716，P均<0.05）。

表3 RRMS兩組患者血清miR-326水平與NSE、MBP的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis between serum miR-326 level and NSE，MBP in two RRMS groups

3 討論

MS 作為一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘脫失為主要特點(diǎn)的炎癥自身免疫性疾病，研究普遍認(rèn)為它屬于自身免疫性疾病，但確切的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚。而固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答參與了MS 疾病的發(fā)生發(fā)展這一說(shuō)法得到了公認(rèn)。而近期越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA 能通過(guò)靶向效應(yīng)對(duì)免疫系統(tǒng)中重要的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子表達(dá)產(chǎn)生影響［6］。而表觀遺傳學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)某些miRNA 表達(dá)的異常與MS、SLE 及RA 等自身免疫性疾病的發(fā)生存在聯(lián)系，它可能通過(guò)影響T 細(xì)胞、B 細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的分化和激活而調(diào)控免疫效能，這可能與MS 的發(fā)病啟動(dòng)有關(guān)聯(lián)［7-9］，畢竟CD4+T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)被看作為導(dǎo)致MS 發(fā)病的重要因素。其中高表達(dá)的miR-326 可以抑制靶基因產(chǎn)物Ets-1（一種調(diào)節(jié)Th17 分化的負(fù)性因子）的表達(dá)，從而加重自身免疫性疾病患者的病情［4］，研究表明在MS患者的外周血淋巴細(xì)胞中出現(xiàn)miRNA-326 的表達(dá)與Th17 細(xì)胞的分化存在著明顯的正相關(guān)關(guān)系，并在CD4+T 細(xì)胞中也通過(guò)熒光原位雜交的方法檢測(cè)到miRNA-326 與IL-17A 之間的共表達(dá)現(xiàn)象，這對(duì)于了解MS 的發(fā)病機(jī)制及對(duì)預(yù)后的判斷具有非常重要的臨床指導(dǎo)意義［10-11］。本臨床研究中也發(fā)現(xiàn)在RRMS緩解期和急性期時(shí)外周血中miR-326 水平均顯著高于健康對(duì)照組，而急性期中升高的更加明顯，說(shuō)明miR-326參與了MS的發(fā)生發(fā)展。

眾所周知，自身免疫性T 淋巴細(xì)胞對(duì)機(jī)體有直接靶向攻擊作用。研究發(fā)現(xiàn)，多種自身免疫性疾病中可能存在一些特異性T細(xì)胞直接攻擊髓鞘及神經(jīng)元，造成神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞的鈣水平顯著升高，最后這些結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的壞死［12-13］。可見在MS 等疾病進(jìn)展過(guò)程中，通過(guò)駐留在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的自身免疫性T淋巴細(xì)胞不斷地激活活化并釋放出大量的炎癥細(xì)胞因子而直接對(duì)神經(jīng)元及髓鞘等結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致病情的進(jìn)一步加重［14］。作為特異性的神經(jīng)內(nèi)分泌因子，NSE 在正常穩(wěn)定狀態(tài)下特異性地存在于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞及神經(jīng)元中，作為糖酵解關(guān)鍵酶維持著神經(jīng)元的生理功能及穩(wěn)定；而MBP 則是參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中髓鞘構(gòu)成的一種特異性堿性蛋白，它與髓鞘的脂質(zhì)之間緊密結(jié)合，對(duì)CNS 髓鞘的功能與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用［15-17］。當(dāng)髓鞘甚至神經(jīng)元發(fā)生損害后，NSE 及MBP 可從細(xì)胞內(nèi)迅速進(jìn)入到細(xì)胞間隙，進(jìn)而通過(guò)受損的血腦屏障進(jìn)入到外周血中，所以NSE、MBP 是作為反映CNS 中神經(jīng)元損害的客觀指標(biāo)［18］。

本研究發(fā)現(xiàn)RRMS患者無(wú)論急性期組還是緩解期組比較于健康對(duì)照組都存在NSE 及MBP 水平的高表達(dá)，以急性期組更為明顯，這說(shuō)明RRMS患者存在著髓鞘及神經(jīng)元的損害，并且在疾病復(fù)發(fā)急性期時(shí)損害程度更嚴(yán)重，而將上述兩指標(biāo)與miR-326 的相對(duì)表達(dá)量行相關(guān)性分析后得出RRMS患者兩組的miR-326 水平與NSE、MBP 的表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系。說(shuō)明miR-326可能通過(guò)免疫介導(dǎo)造成髓鞘及神經(jīng)元損傷而參與了RRMS的發(fā)生發(fā)展。推測(cè)其機(jī)制可能與miR-326 通過(guò)調(diào)節(jié)CD4+T 淋巴細(xì)胞的活化，并釋放大量的炎性細(xì)胞因子，從而直接對(duì)MMRS 患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的髓鞘及神經(jīng)元進(jìn)行攻擊造成損害，導(dǎo)致NSE 和MBP 迅速通過(guò)受損血腦屏障進(jìn)入外周血中有關(guān)［19］。

綜上所述，RRMS 患者的外周血清中miR-326的表達(dá)水平顯著升高，以急性期更明顯，且miR-326的水平表達(dá)與NSE、MBP 均呈正相關(guān)關(guān)系，但有關(guān)MS 發(fā)病與miR-326 之間的具體機(jī)制，目前尚不清楚，仍然需要進(jìn)一步的研究探索。