楊 慧 李 浩 馮立爽 楊卓東 楊 煜

（吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，長春130021）

皮膚作為人體最大的一個器官，是抵御外界刺激的第一道防線。在過去的30年中，各類皮膚炎癥疾病以及皮膚癌的發(fā)病率一直在不斷增加［1］。流行病學(xué)研究表明，UV 輻射仍然是皮膚癌最重要的可干預(yù)風(fēng)險(xiǎn)因素［2］。太陽紫外線輻射（UV）可分為UVA（315～400 nm），UVB（280～315 nm）和 UVC（100～280 nm）。UVB 輻射是導(dǎo)致皮膚癌的主要危險(xiǎn)因素［3］。過量的UVB 暴露會破壞體內(nèi)生物大分子，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，使細(xì)胞產(chǎn)生自由基，發(fā)生氧化應(yīng)激、凋亡等反應(yīng)，最終導(dǎo)致皮膚炎癥性疾病、皮膚癌等［4-6］。然而，UVB 是否通過影響免疫系統(tǒng)介導(dǎo)皮膚損傷還未明確。

Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR）是參與非特異性免疫（天然免疫）的一類重要蛋白質(zhì)分子，主要表達(dá)在免疫細(xì)胞上，通過識別多種病原微生物進(jìn)化中的保守分子如酵母多糖、脂多糖、肽聚糖等，激活細(xì)胞內(nèi)信號傳遞，介導(dǎo)天然免疫，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。目前已發(fā)現(xiàn)11 種TLR（TLR1～11）。有研究表明，TLR2 和 TLR4 參與多種皮膚疾病的發(fā)生發(fā)展，并且皮膚炎癥性疾病中TLR2、TLR4的表達(dá)升高，但其是否參與UVB誘導(dǎo)的皮膚炎癥性疾病并不清楚［5］。研究顯示皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞如HaCaT 中也可表達(dá)TLR2 和TLR4，因此是否是皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞本身，而非免疫細(xì)胞中表達(dá)的TLR2 或TLR4 參與UVB 誘導(dǎo)的皮膚損傷并不清楚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞為應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯誤折疊與未折疊蛋白聚集以及鈣離子平衡紊亂等狀況，而激活未折疊蛋白反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)和cas?pase 介導(dǎo)的凋亡通路等信號途徑的反應(yīng)過程［7］。TLRs 激活或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被誘導(dǎo)所產(chǎn)生的信號可以相互融合，促進(jìn)病理炎癥反應(yīng)，損傷皮膚角質(zhì)細(xì)胞并最終可引起細(xì)胞凋亡，但目前TLR 信號和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相互作用的機(jī)制尚不清楚［8］。C29是TLR2 抑制劑，TAK-242 是TLR4 抑制劑，二者可有效阻斷這2 個受體相關(guān)的信號通路，因此常采用2 種抑制劑，阻斷相應(yīng)的信號傳導(dǎo)通路用于各種研究工作。

本文擬利用C29和TAK-242 探討阻斷TLR2 和TLR4 能否緩解UVB 導(dǎo)致的HaCaT 細(xì)胞損傷作用并分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的變化，探究TLR2 和TLR4 在UVB所致的細(xì)胞損傷中的作用。為預(yù)防及治療UVB 引起的皮膚疾病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（human immor?tal keratinocyte，HaCaT）購自中科院上海細(xì)胞庫。C29、TAK-242（MCE 中國皓元生物公司）；一抗Cas?pase8、NF-κB、p-NF-κB、PERK、P-PERK、IRE1α（美國CST 公司）；GAPDH（北京博奧森公司）；山羊抗兔、鼠（北京鼎國昌盛公司）。

1.2 方法

1.2.1 HaCaT 細(xì)胞培養(yǎng) 含10%胎牛血清（BI，以色列）的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)HaCaT 細(xì)胞，將細(xì)胞置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中。每隔48 h 更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合至80%左右時，進(jìn)行消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞分組及處理 正常組：正常培養(yǎng)的Ha?CaT 細(xì)胞；UVB 組：細(xì)胞給予 UVB 照射處理；UVB+C29組：細(xì)胞給予 C29預(yù)處理 2 h 后，給予 UVB 照射；UVB+TAK-242組：細(xì)胞給予TAK-242預(yù)處理2 h后，給予UVB照射；UVB+C29+TAK-242組：細(xì)胞給予C29和TAK-242預(yù)處理2 h后，再給予UVB照射。

1.2.3 UVB 照射HaCaT 細(xì)胞 取對數(shù)生長期的HaCaT 細(xì)胞，3×103個/孔細(xì)胞接種 96 孔板，每組設(shè)置6個復(fù)孔，分別照射不同時間：30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s、210 s、240 s，照射時將培養(yǎng)皿蓋子打開置于紫外線燈下，培養(yǎng)皿距離燈源約20 cm，總輻射劑量30 mJ/cm2。

1.2.4 MTT 法檢測HaCaT 細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期的HaCaT 細(xì)胞，3×103個/孔細(xì)胞接種于96 孔板，每組各設(shè)置6個復(fù)孔，根據(jù)細(xì)胞不同分組進(jìn)行不同處理。然后根據(jù)MTT 試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，每孔加入10 μl MTT（5 g/L），置于37℃ 孵育4 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μl DMSO，振動5 min 后，使用酶標(biāo)儀測量反應(yīng)溶液在490 nm 處的吸光度值。根據(jù)說明書給出的公式計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%（As 為實(shí)驗(yàn)組吸光度值、Ab為空白組吸光度值、Ac為對照組吸光度值）。

1.2.5 TLR2、TLR4 抑制劑 C29和 TAK-242 處理 Ha?CaT細(xì)胞 取對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞，3×103個/孔細(xì)胞接種96 孔板，每組設(shè)置6 個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后分別給予含 5 μmo/lL、10 μmo/lL、25 μmo/lL、50 μmo/lL、75 μmo/lL、100 μmo/lL、150 μmo/lL、200 μmo/lL、250 μmo/lL 濃度的 C29和 0 μmo/lL、0.01 μmo/lL、0.1 μmo/lL、1 μmo/lL、2 μmo/lL、5 μmo/lL、10 μmo/lL、12 μmo/lL、15 μmo/lL、20 μmo/lL 濃度的 TAK-242（培養(yǎng)基培養(yǎng) 2 h，根據(jù)MTT試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，使用酶標(biāo)儀測定反應(yīng)溶液在490 nm 處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%（As 為實(shí)驗(yàn)組吸光度值、Ab為空白組吸光度值、Ac為對照組吸光度值）。

1.2.6 Western blot 法檢測蛋白表達(dá) 棄掉培養(yǎng)皿的培養(yǎng)液，用PBS 緩沖液清洗細(xì)胞2 遍，然后用0.25%胰蛋白酶將細(xì)胞消化并轉(zhuǎn)移到EP管中，加入適量的培養(yǎng)液1 000/rmin，5 min離心；棄掉上清，加入適量 PBS 緩沖液重懸細(xì)胞，2 000/rmin，5 min 離心；重復(fù)此步驟2 次；每管細(xì)胞中加入200 μl 的RIPA 裂解液，然后用量程為200 μl的槍頭小心將細(xì)胞重懸，冰上裂解30 min，每5 min 振蕩1 次；裂解完畢后，4℃，12 000/rmin，離心5 min；吸取上清至準(zhǔn)備好的另一新EP 管，4℃存放、準(zhǔn)備BCA 蛋白定量；將標(biāo)準(zhǔn)蛋白BCA 按照試劑說明書配制成濃度為25 mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白母液，然后準(zhǔn)確吸取3 μl 標(biāo)準(zhǔn)蛋白母液、147 μl 的 RIPA 裂解液，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白母液稀釋成濃度為0.5 mg/ml。稀釋標(biāo)準(zhǔn)蛋白，取待測樣品，進(jìn)行蛋白定量。然后按照Western blot常規(guī)測定方法，進(jìn)行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、顯影。分別加入一抗Caspase-8（兔抗人 1∶1 000 倍稀釋）、NF-κB（鼠抗人1∶1 000倍稀釋）、p-NF-κB（鼠抗人1∶1 000倍稀釋）、PERK（兔抗1∶1 000倍稀釋）、P-PERK（兔抗1∶1 000倍稀釋）和IRE1α（兔多抗1∶500 倍稀釋）的表達(dá)，內(nèi)參選擇 GAPDH（兔抗人1∶2 000 倍稀釋），二抗為HRP 標(biāo)記的山羊抗兔、鼠（1∶1 000 倍稀釋），通過ECL 發(fā)光顯影檢測，并通過Image J 軟件進(jìn)行蛋白灰度值測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用表示，多組之間進(jìn)行比較采用單因素方差分析ANOVA，兩兩比較采用SNK法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 UVB 最佳照射時間的確定 為了確定UVB 照射造成HaCaT 細(xì)胞損傷作用的最佳時間，采用MTT法檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示隨著UVB 照射時間的延長，HaCaT 細(xì)胞的存活率逐漸降低，UVB 照射時間為 22.5 s、45.0 s、67.5 s 組 HaCaT 細(xì)胞的存活率與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；UVB 照射 時 間為 90 s、112.5 s、135 s、157.5 s、180 s 和202.5 s組HaCaT 細(xì)胞的存活率顯著低于正常組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），因此本研究選取90 s 作為該實(shí)驗(yàn)的UVB照射時間。見圖1。

圖1 MTT 法測定UVB 照射不同時間后HaCaT 細(xì)胞的存活率Fig.1 MTT assay was used to determine survival rate of HaCaT cells for different UVB exposure time

2.2 TLR2和TLR4在UVB致HaCaT損傷中的作用

2.2.1 TLR2 抑 制 劑 C29對 UVB 致 HaCaT 損 傷 的影響 采用濃度分別為 10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmo/lL、75 μmo/lL 和 100 μmo/lL 的 C29處 理HaCaT 細(xì)胞2 h后，經(jīng)UVB 照射，各組細(xì)胞存活率均低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），除正常組外，150 μmo/lL、200 μmo/lL 和 250 μmo/lL 的C29處理 細(xì)胞后，經(jīng)UVB 照射，HaCaT 細(xì)胞存活率均高于其他各濃度組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。C29150 μmo/lL 濃度處理的 HaCaT 細(xì)胞，經(jīng)UVB 照射后，其存活率達(dá)103.0%，提示隨著C29濃度的增加，通過抑制TLR2 可逐漸恢復(fù)UVB 造成的細(xì)胞損傷，其中150 μmo/lL 時可恢復(fù)至正常水平，可能由于抑制劑的毒性作用導(dǎo)致細(xì)胞損傷，因此確定150 μmo/lL為本實(shí)驗(yàn)的最佳處理濃度。見圖2。

圖2 MTT法測定不同濃度C29處理后HaCaT細(xì)胞的存活率Fig.2 MTT assay was used to determine survival rate of HaCaT cells treated with different concentrations of C29

2.2.2 TLR4抑制劑TAK-242對UVB致HaCaT損傷的影響 采用濃度分別為0.01 μmo/lL、0.1 μmo/lL、1 μmo/lL、2 μmo/lL、5 μmo/lL、10 μmo/lL、12 μmo/lL、15 μmo/lL 和 20 μmo/lL 的 TAK-242 處理 HaCaT 細(xì)胞2 h后，經(jīng)UVB 照射，結(jié)果顯示HaCaT 細(xì)胞的存活率隨 TAK-242 濃度增加而增加，在 2 μmo/lL 時 Ha?CaT 細(xì)胞的存活率達(dá)到最大為98.9%，隨著TAK-242 濃度的增加，HaCaT 細(xì)胞的存活率降低，可能是由于抑制劑濃度過高導(dǎo)致的毒性作用。TAK-242 2 μmo/lL 時的HaCaT 細(xì)胞存活率均高于其他濃度組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示通過抑制TLR4可逐漸恢復(fù)UVB造成的細(xì)胞損傷，且2 μmo/lL時效果最好，因此確定2 μmo/lL 為本實(shí)驗(yàn)的最佳處理濃度。見圖3。

圖3 MTT 法測定不同濃度TAK-242 處理后HaCaT 細(xì)胞的存活率Fig.3 survival rate of HaCaT cells treated with different concentrations of TAK-242 was determined by MTT assay

2.3 各組細(xì)胞Caspase-8表達(dá)水平比較 為了進(jìn)一步探討 TLR2 和 TLR4 在 UVB 對 HaCaT 細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制，是否通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低，采用Western blot 方法檢測了UVB、UVB+TLR2、UVB+TLR4 及 UVB+TLR2-4 組中細(xì)胞凋亡分子Caspase-8的表達(dá)。結(jié)果如圖4顯示，與UVB 組相比，UVB+TLR2 組Caspase-8 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）；UVB+TLR4 組 Caspase-8 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）；UVB+TLR2-4 組 Caspase-8 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01）。說明TLR2 及TLR4 抑制劑聯(lián)合應(yīng)用可能通過抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。

圖4 Western blot法檢測各組凋亡蛋白Caspase-8表達(dá)Fig.4 Western blot was used to detect expression of Cas?pase-8

2.4 TLR2 及TLR4 抑制劑對UVB 導(dǎo)致細(xì)胞損傷中氧化應(yīng)激相關(guān)分子NF-κB、p-NF-κB 表達(dá)的影響 為了探討氧化應(yīng)激相關(guān)分子NF-κB 的表達(dá)參與UVB 引起的HaCaT 細(xì)胞損傷過程，采用Western blot方法檢測NF-κB、p-NF-κB 蛋白的表達(dá)。結(jié)果如圖5所示，與 UVB 組相比，UVB+TLR2 組、UVB+TLR4 組和 UVB+TLR2-4 組 NF-κB 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05），其中UVB+TLR2-4組NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)顯著（P<0.05）；UVB+TLR4組下調(diào)明顯低于UVB+TLR2組（P<0.05）。與 UVB 組相比，UVB+TLR2 組 p-NF-κB 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05），UVB+TLR4 和TLR2-4組明顯下調(diào)，其中TLR2-4組p-NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)更加顯著。提示TLR2、TLR4 可能通過NF-κB 信號通路參與UVB 導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，抑制劑TLR2、TLR4能逆轉(zhuǎn)該過程。

圖5 Western blot 法檢測各組細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白NF-κB和p-NF-κB表達(dá)Fig.5 Western blot was used to detect expression of in?flammatory protein NF-κB and p-NF-κB

2.5 TLR2 及TLR4 抑制劑對UVB 導(dǎo)致細(xì)胞損傷中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子IRE1α、PERK、p-PERK 表達(dá)的影響 為了探討TLR2、TLR4 是否還可通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與UVB 介導(dǎo)的細(xì)胞損傷，采用Western blot 檢測了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白IRE1α、PERK、p-PERK 的表達(dá)，結(jié)果如圖6A 所示，與UVB 組相比，UVB+TLR2組、UVB+TLR4組、UVB+TLR2-4組IRE1α蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05），其中UVB+TLR2-4 組IRE1α 蛋白表達(dá)下調(diào)更加顯著（P<0.05）。如圖6B所示，與 UVB 組相比，UVB+TLR2 組、UVB+TLR4組、UVB+TLR2-4 組 PERK 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05），其中 UVB+TLR4 組 PERK 蛋白表達(dá)下調(diào)更加顯著（P<0.05）。如圖 6C 所示，與 UVB 組相比，UVB+TLR2 組 、UVB+TLR4 組 、UVB+TLR2-4 組 p-PERK 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05），其中UVB+TLR2-4 組p-PERK 蛋白表達(dá)下調(diào)更加顯著（P<0.05），UVB+TLR4 組下調(diào)顯著低于 UVB+TLR2 組（P<0.05）。結(jié)果提示TLR2、TLR4 可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑參與UVB 導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，拮抗TLR2、TLR4能逆轉(zhuǎn)該過程。

圖6 Western blot 法檢測各組細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白IRE1α、PERK、p-PERK表達(dá)Fig.6 Western blot was used to detect expressions of en?doplasmic reticulum stress-related proteins IRE1α，PERK and p-PERK

3 討論

由于人類活動影響，氮氧空洞不斷擴(kuò)大，越來越多的UVB 照射到地球上，引起了眾多的疾病。皮膚作為全身最大的器官，又是第一道免疫防線，受到的影響較大。天然免疫在皮膚免疫性疾病、皮膚腫瘤，特別是皮膚炎癥疾病中發(fā)揮非常重要的作用，其中由于UVB 導(dǎo)致的皮膚炎癥疾病患者日益劇增引起廣泛的關(guān)注。目前研究發(fā)現(xiàn)UVB 導(dǎo)致的皮膚炎癥疾病可能與DNA 損傷，促炎癥因子釋放，氧化應(yīng)激與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，T 淋巴細(xì)胞異?；罨扔嘘P(guān)。

大量研究表明TLRs 不僅可以識別細(xì)菌和病毒的病原體相關(guān)分子模式，還可以識別衰老死亡或受損的細(xì)胞中的損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs），激活細(xì)胞內(nèi)信號分子的級聯(lián)反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)識別和清除有害物質(zhì)，從而在免 疫反 應(yīng)中發(fā) 揮重要 作用［9］。 TLR2 和 TLR4 是TLRs家族的一員，二者均是重要的天然免疫受體之一，當(dāng)有細(xì)菌、病毒和真菌等病原體入侵時，以及體內(nèi)產(chǎn)生的DAMP均可激活TLRs受體，進(jìn)而促進(jìn)促炎轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，例如NF-κB和COX2等［10-14］。還有研究表明，DAMP 模式包括氧化的低密度脂蛋白（oxLDL）和氧化的磷脂（oxPL），可上調(diào)NF-κB 表達(dá)機(jī)制引發(fā)NLRP3 炎癥體，通過髓樣分化蛋白-88（MyD-88）依賴途徑，進(jìn)一步介導(dǎo) NF-κB 磷酸化入核，調(diào)控各種細(xì)胞炎癥因子如IL-1、TNF-α 等釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［15-17］。Caspase-8作為細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，是細(xì)胞凋亡過程中重要的標(biāo)志分子之一。本實(shí)驗(yàn)采用C29和TAK-242 作為TLR2 和TLR4的抑制劑，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著UVB 照射時間的延長，HaCaT 細(xì)胞存活率顯著下降，本研究發(fā)現(xiàn)與UVB 組相比，UVB+TLR4 組和 UVB+TLR2-4 組的 HaCaT 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-8 和細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白 NF-κB 表達(dá)水平下降，其中 UVB+TLR2-4 組蛋白表達(dá)水平下降更加明顯。推測可能是由于UVB照射導(dǎo)致的體內(nèi)的DAMP 產(chǎn)生增加，通過TLR2 和TLR4信號通路激活下游NF-κB分子，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示 TLR2 抑制劑 C29作用后，UVB 處理的 HaCaT 細(xì)胞中Caspase-8 和p-NF-κB 表達(dá)較對照組升高，分析其原因可能是由于該抑制劑可能作用于細(xì)胞內(nèi)其他信號分子，參與調(diào)控細(xì)胞損傷的修復(fù)作用，且該抑制劑也可能通過影響其他凋亡途徑分子或其他凋亡途徑發(fā)揮的抑制凋亡作用，但還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

有研究表明，UVB 可誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧ROS 等成分，并對不同細(xì)胞成分如細(xì)胞核、脂質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及線粒體等產(chǎn)生氧化損傷［18-19］。氧化應(yīng)激反應(yīng)可能是皮膚細(xì)胞受到UVB 損傷后發(fā)生的主要反應(yīng)，HaCaT 細(xì)胞與人類角質(zhì)層細(xì)胞十分相似，可以無限傳代，并且Toll 樣受體在其內(nèi)均有表達(dá)。TLR-2 和TLR-4 是氧化應(yīng)激中的一個重要受體，參與許多信號通路傳導(dǎo)，因此猜測阻斷這兩個受體相關(guān)的傳導(dǎo)通路可能會終止部分氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕細(xì)胞損傷。MISTRY 等［20］研究結(jié)果證實(shí)，TLR2 和 TLR4抑制劑干預(yù)可以明顯減緩氧化應(yīng)激所致的THP-1巨噬細(xì)胞，HEK293T 等細(xì)胞凋亡的發(fā)生和細(xì)胞炎癥因子的釋放。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TLR2 和TLR4 抑制劑可降低UVB 導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，TLR4 抑制劑使用效果明顯優(yōu)于TLR2 抑制劑，且兩者使用效果更好。這可能是通過抑制TLR-4/MyD-88/NF-κB 絲裂原激活的蛋白激酶和半胱天冬酶途徑的激活，并下調(diào)氧化劑的釋放，從而降低了炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激以及凋亡的發(fā)生［21］。但還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

UVB 可以導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊的蛋白積聚和Ca2+失衡。SHIMASAKI 等［22］研究結(jié)果表明，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)物如毒胡蘿卜素，衣霉素或二硫蘇糖醇會增加上皮細(xì)胞TLR2 的表達(dá)，還增強(qiáng)了TLR2 配體的反應(yīng)性，說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在調(diào)節(jié)TLR2 依賴性炎癥反應(yīng)中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，West?ern blot 檢測HaCaT 細(xì)胞被UVB 照射后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達(dá)水平變化顯示，與UVB 組對比，UVB+TLR2 組和 UVB+TLR4 組的 IRE1、PERK 和 P-PERK蛋白表達(dá)明顯下降（P<0.05），TLR2-4組蛋白表達(dá)下降更加顯著（P<0.05）。通過加入 TLR2 和 TLR4 抑制劑可以明顯降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的表達(dá)，說明通過阻斷TLR2 和TLR4 受體通路可以緩解UVB 造成的HaCaT 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷，并且兩種抑制劑一起使用抑制效果更好。

綜上所述，本研究初步證明UVB 可以導(dǎo)致Ha?CaT 細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并使細(xì)胞發(fā)生凋亡，通過阻斷TLR2 和TLR4 信號途徑可緩解UVB 造成的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷，從而可能抑制了UVB 對細(xì)胞損傷作用，本研究為以TLR2 及TLR4 為靶點(diǎn)治療UVB 所致皮膚炎癥疾病提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。