李浩月 鐘達(dá)源 鄧奕輝

湖南中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410208

2 型糖尿病是一種常見疾病，有研究預(yù)測2025 年全世界將有3.8 億糖尿病患者[1]，其中15%[2]合并有糖尿病神經(jīng)病變，多出現(xiàn)慢性疼痛[3]。目前用于糖尿病神經(jīng)病變治療的藥物有多種，但臨床療效欠佳[4]，故尋找新的糖尿病神經(jīng)病變的治療方法是關(guān)鍵。糖尿病神經(jīng)病變歸屬于中醫(yī)的“消渴”“血痹”等范疇。段力等[5]研究發(fā)現(xiàn)，2 型糖尿病周圍神經(jīng)病變是本虛標(biāo)實，其中標(biāo)實以血瘀為主。研究[6]表明，丹參酮Ⅱ A 與胰島素聯(lián)用能有效抑制周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡，升高線粒體膜電位，抑制Bax 和Cytochrome C 轉(zhuǎn)位，還能抑制IκB 蛋白磷酸化和核因子-κB 活化，從而抑制促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[7]，可見丹參酮Ⅱ A 有活血化瘀的功效。目前丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經(jīng)病變起效的具體機(jī)制尚未清晰，因此本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法進(jìn)行預(yù)測，為其后續(xù)的機(jī)制研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫來源及軟件

PubChem 數(shù)據(jù)庫[8]、PharmMapper 數(shù)據(jù)庫[9]、CTD數(shù)據(jù)庫[10]、Cytoscape 3.6.1 軟件、OpenBabel-2.4.1 軟件、chimera1.14 軟件、IGEMDOCK 軟件、Pymol 軟件、DAVID 數(shù)據(jù)庫[11]、STRING 數(shù)據(jù)庫[12]、PDB 數(shù)據(jù)庫[13]。

1.2 丹參酮Ⅱ A 靶點的收集及處理

通過PubChem 數(shù)據(jù)庫查找丹參酮Ⅱ A 的結(jié)構(gòu)并將其導(dǎo)入PharmMapper 數(shù)據(jù)庫以預(yù)測其作用靶點；將靶點名注釋后通過STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；通過CTD 數(shù)據(jù)庫檢索糖尿病神經(jīng)病變疾病靶點，將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的靶點與疾病靶點相交取共同子集，即得到丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經(jīng)病變的靶點。

1.3 丹參酮Ⅱ A 與疾病靶點的分子對接

通過PDB 數(shù)據(jù)庫下載靶點蛋白的pdb 結(jié)構(gòu)文件并通過chimera1.14 軟件進(jìn)行去配體加氫處理，其次通過PubChem 數(shù)據(jù)庫下載丹參酮Ⅱ A 的sdf 格式文件，再通過OpenBabel-2.4.1 轉(zhuǎn)換成pdb 文件，最后再通過chimera1.14 軟件去配體加氫處理后通過IGEMDOCK 軟件計算丹參酮Ⅱ A 與靶點蛋白的分子對接結(jié)合評分。再通過Pymol 軟件進(jìn)行丹參酮Ⅱ A 與靶點蛋白結(jié)合的可視化。

1.4 丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經(jīng)病變關(guān)鍵靶點的GO及KEGG 通路分析

將丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經(jīng)病變的靶點通過DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）及京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析；設(shè)定顯著程度P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮Ⅱ A 靶點的預(yù)測與篩選

通過PubChem 數(shù)據(jù)庫查找丹參酮Ⅱ A 的3D 結(jié)構(gòu)并將其導(dǎo)入PharmMapper 數(shù)據(jù)庫以預(yù)測其分子對接靶點，以Normfit >0.7 作為篩選參數(shù)進(jìn)行篩選，得到丹參酮Ⅱ A 靶點17 個，分別是AKR1B1、ALB、CASP3、CCNA2、CDK2、EGFR、KDR、MAOB、MAPK1、MAPK14、MAPK8、MMP13、MMP3、NOS3、PPARD、PPARG、RXRA。

2.2 丹參酮Ⅱ A 與靶點蛋白的分子對接得分及結(jié)構(gòu)

將丹參酮Ⅱ A 與17 個靶點蛋白進(jìn)行分子對接，結(jié)果顯示丹參酮Ⅱ A 與17 個靶點分子對接評分均＜-6 分，提示丹參酮Ⅱ A 與17 個靶點對接良好。見表1。對接結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 丹參酮Ⅱ A 與10 個靶點蛋白的分子對接結(jié)構(gòu)

表1 丹參酮Ⅱ A 與17 個靶點蛋白的分子對接得分表

2.3 GO 富集分析

將17 個丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經(jīng)病變的靶點通過DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 富集分析，以P <0.05進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經(jīng)病變主要涉及肽基絲氨酸磷酸化、脂多糖介導(dǎo)的信號通路、凋亡過程的負(fù)調(diào)控等25 個相關(guān)生物功能。見表2。

表2 丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經(jīng)病變的GO 富集分析結(jié)果

2.4 KEGG 富集分析

將17 個丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經(jīng)病變的靶點通過DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG 富集分析，以P <0.05進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經(jīng)病變主要涉及TNF 信號通路、FoxO 信號通路、VEGF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路等19 條通路；其中PI3K-Akt信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路、FoxO 信號通路富集的靶點最多，以這幾條通路進(jìn)行驗證的成功率較高。見表3。

表3 丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經(jīng)病變的KEGG 富集分析結(jié)果

3 討論

糖尿病是一個快速增長的慢性系統(tǒng)性疾病，2013 年我國糖尿病患病率已高達(dá)10.4%[14]，2016 年全球糖尿病患者約3.82 億[15]。糖尿病又分為1 型糖尿病和2 型糖尿病，雖然這兩種類型糖尿病的發(fā)病機(jī)制不同，但它們都會導(dǎo)致共同的結(jié)果，即高血糖。一旦高血糖發(fā)生，兩種類型糖尿病患者都有可能發(fā)展成同樣的慢性并發(fā)癥。其中以神經(jīng)病變最為易見，患病率約為50%[16]。目前針對該病多在控制血糖的基礎(chǔ)上，輔以營養(yǎng)神經(jīng)的藥物方式來干預(yù)，從而改善癥狀，但該方式未能根治[17]。且由于治療的長期性，患者的醫(yī)療負(fù)擔(dān)較重。中醫(yī)藥是我國寶貴的醫(yī)療寶庫，其中記載了大量糖尿病神經(jīng)病變的理法方藥，在疾病癥狀改善及預(yù)后方面均有不俗的效果，中醫(yī)藥有可能是糖尿病神經(jīng)病變新的治療思路來源。

中醫(yī)本病屬于“消渴”“血痹”的范疇，病機(jī)主要包括陰陽氣血虧虛和痰瘀內(nèi)積兩個方面，丹參酮Ⅱ A 是從丹參的根中分離出的二萜醌，有活血化瘀的功效。動物實驗研究[18]發(fā)現(xiàn)，丹參酮Ⅱ A 可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活來減輕神經(jīng)元凋亡，并改善學(xué)習(xí)和記憶；劉勇等[6]發(fā)現(xiàn)丹參酮Ⅱ A 聯(lián)用胰島素能顯著改善糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠的糖代謝紊亂；還有研究[19]發(fā)現(xiàn)丹參酮Ⅱ A 能夠通過減輕炎癥反應(yīng)來改善糖尿病神經(jīng)病變大鼠的癥狀，這可能與背根神經(jīng)節(jié)的過度興奮及鈉通道蛋白表達(dá)的干預(yù)有關(guān)[20]；另外有研究[21]認(rèn)為可能與Nrf2/ARE 信號通路的激活有關(guān)。這些研究均顯示丹參酮Ⅱ A 對糖尿病神經(jīng)病變具有確切療效。

然而糖尿病神經(jīng)病變是一個復(fù)雜的疾病，其與多個靶點、多條途徑及多個臟腑均存在聯(lián)系，因此具體分析丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經(jīng)病變的機(jī)制難度較大。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是研究藥物作用機(jī)制的新模式[22-23]，可以通過網(wǎng)絡(luò)化模型對丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經(jīng)病變的靶點、代謝途徑及分子機(jī)制進(jìn)行精細(xì)化分析。通過該方法，本研究發(fā)現(xiàn)丹參酮Ⅱ A 具有多靶點特性，主要涉及肽基絲氨酸磷酸化、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等25 個相關(guān)生物功能，涉及的信號通路有TNF 信號通路、FoxO 信號通路、VEGF 信號通路等19 條通路，其中PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路、FoxO 信號通路，以這幾條通路進(jìn)行驗證的成功率較高，而這也得到了實驗證據(jù)[24-28]的支持。本研究結(jié)果可以為丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經(jīng)病變的機(jī)制研究提供重要參考和依據(jù)。