曹獻(xiàn)馗 謝 斌 邵 旸 林 杰

遼寧省腫瘤醫(yī)院普外科，遼寧沈陽 110042

胃癌（gastric cancer，GC）是常見的消化道腫瘤[1]，患者早期無明顯癥狀[2]，導(dǎo)致診斷延遲，轉(zhuǎn)移率高[3]，尋找有效的靶點對治療GC 至關(guān)重要[4]。GC 的發(fā)生發(fā)展與基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的失衡密切相關(guān)[5]，人類基因組中存在大量的非編碼蛋白質(zhì)的RNA[6]。其中，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和染色質(zhì)修飾等生理過程，在腫瘤發(fā)生中具有重要作用[7]，與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[8-9]。本研究顯示lncRNA FAL1 在GC 細(xì)胞中過表達(dá)，參與腫瘤增殖和凋亡?，F(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901、BGC-823 及正常胃黏膜細(xì)胞GES-1 取自遼寧省腫瘤醫(yī)院中心實驗室。所有細(xì)胞系均在含10%胎牛血清（Hyclone，通用生命科學(xué)，美國）DMEM 培養(yǎng)基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium，sigma，美國）中培養(yǎng)，另加100 U/ml 鏈霉素和100 U/ml 青霉素（Thermo Fisher Scientific，美國）。培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。設(shè)計并合成了2 種以FAL1為靶點的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA；genechem，中國），分別為si-FAL1#1 組及si-FAL1#2組。構(gòu)建STAT3 過表達(dá)pcDNA3.1 質(zhì)粒（Invitrogen，美國）。細(xì)胞接種于六孔板，密度1.8×105/孔，并置于37℃培養(yǎng)條件24 h。細(xì)胞于含10%胎牛血清、不含抗生素的DMEM 中培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染相應(yīng)載體48 h。收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實驗。

1.2 RT-PCR

TRIzol 法提取樣本總RNA，檢測純度及濃度。逆轉(zhuǎn)錄和PCR 反應(yīng)均嚴(yán)格按照TAKARA 公司說明書進(jìn)行，以U6 作為內(nèi)參進(jìn)行相對定量，每組設(shè)3 個復(fù)孔，ROCHE 實時定量熒光PCR 儀進(jìn)行檢測。FAL1 的正向引物序列：5’-CCTGGCCAAGAAGCTCATAG-3’，反向引物序列：5’-TGAGGACACCGACTACTGAGAA-3’；STAT3 的正向引物序列：5’-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3’，反向引物序列：5’-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3’；U6 的正向引物序列：5’-TTATGGGTCAGGCAGAAGCAGAGGTAGCTAGCCTGAC-3’，反向引物序列：5’-CACTATTGCGGGCTGC-3’。采用2-△△Ct法計算兩者的相對表達(dá)量。△Ct=Ctmarker-CtU6。PCR 條件：95℃，5 min；95℃，30 s；8℃，30 s；72℃，45 s；32 個循環(huán)，72℃，10 min。

1.3 Western blot

提取總蛋白，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE；Beyotime，中國）。隨后，轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜（Millipore，美國）。室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜1 h，然后與STAT3（1∶1000，Proteintech，美國）和β-actin（1∶5000，Proteintech，美國）孵育過夜。膜洗滌3 次，二抗（1∶5000，Proteintech，USA）室溫孵育1 h，顯影成像，ImageJ 分條帶灰度值。

1.4 CCK-8

依據(jù)CCK-8 系統(tǒng)（Dojindo，日本）測定細(xì)胞活力。細(xì)胞接種在96 孔板中（每孔1×104個細(xì)胞）。細(xì)胞于37℃黑暗孵育，于培養(yǎng)0、24、48、72 h 每孔加入10 μl CCK-8 溶液，再孵育4 h。然后使用酶標(biāo)儀（Tecan，瑞士）在450 nm 處評估每個孔的吸光度。

1.5 Annexin V-FITC PI 雙染色檢測細(xì)胞凋亡

細(xì)胞處理后，用4℃PBS 對細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶化和洗滌。根據(jù)操作手冊，使用Annexin V/PI 檢測試劑盒（Molecular Probes Inc.Eugene，OR）在黑暗中孵育細(xì)胞懸液15 min。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡（Beckman Coulter，USA），實驗重復(fù)3 次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t 檢驗或方差分析。計數(shù)資料以例數(shù)表示。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAL1、STAT3 在GC 細(xì)胞及胃黏膜上皮細(xì)胞中表達(dá)情況

RT-PCR 顯示，F(xiàn)AL1 在人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901和BGC-823 中RNA 的表達(dá)高于胃黏膜細(xì)胞GES-1中表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），見圖1A。RTPCR 和Western blot 顯 示，STAT3 在SGC-7901 和BGC-823 中mRNA 表示高于GES-1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），見圖1B～C。

圖1 FAL1、STAT3 在GC 細(xì)胞及胃黏膜上皮細(xì)胞中表達(dá)情況

2.2 下調(diào)FAL1 對STAT3 表達(dá)的影響

RT-PCR 顯示，轉(zhuǎn)染后GC 細(xì)胞中FAL1 表達(dá)量降低（P ＜0.05），見圖2A。胃癌細(xì)胞中STAT3 的表達(dá)同樣下降（P ＜0.05），見圖2B。其中第2 條序列（si-FAL1#2）具有更好的沉默效果，用于后續(xù)表型實驗。

圖2 下調(diào)FAL1 對STAT3 表達(dá)的影響

2.3 FAL1、STAT3 對GC 細(xì)胞增殖能力的影響

將si-FAL1#2 序列轉(zhuǎn)染SGC-7901 和BGC-823細(xì)胞后，細(xì)胞增殖減緩。在此基礎(chǔ)上過表達(dá)STAT3，被抑制的細(xì)胞的增殖能力部分恢復(fù)（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 FAL1 和STAT3 對GC 細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 FAL1、STAT3 對GC 細(xì)胞凋亡能力的影響

將si-FAL1#2 轉(zhuǎn) 染SGC-7901 和BGC-823 細(xì)胞，細(xì)胞早期凋亡明顯增加，過表達(dá)STAT3 后，凋亡細(xì)胞降低（P ＜0.05）。見圖4。

圖4 FAL1 和STAT3 對GC 細(xì)胞凋亡能力的影響

3 討論

闡明胃癌進(jìn)展的遺傳和表觀遺傳學(xué)機制是研究重點，但其機制仍未明確[10-11]。LncRNAs 作為轉(zhuǎn)錄組的重要組成部分，根據(jù)其位置及轉(zhuǎn)錄方式可分為：反義，內(nèi)含子，重疊，長鏈基因間lncRNA，頭對頭及eRNA等多種類型[12]。lncRNA 在不同腫瘤中異常表達(dá)[13-14]，通過表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后修飾，調(diào)控腫瘤相關(guān)基因表達(dá)，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[15-16]。報道顯示lncRNA 作為抗乳腺癌治療腫瘤的靶點，具有一定的臨床價值[17]。血液中游離的lncRNA 是肺癌診斷的分子標(biāo)志物[18]。lncRNAs 在GC 中也存在異常表達(dá)：Zhang等[19]對GC 患者組織及正常組織中LncRNA 進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)TINCR、CCAT2、AOC4P、BANCR、LINC00857等在GC 中表達(dá)上調(diào)。Wang 等[20]發(fā)現(xiàn)LncRNA UCA1通過促進(jìn)Cbl-c 介導(dǎo)的GRK2 泛素化調(diào)節(jié)GRK2 蛋白的穩(wěn)定性，提高GC 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。

FAL1 是一條新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，在腫瘤中發(fā)揮重要的功能：FAL1 在骨肉瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，同腫瘤的轉(zhuǎn)移、分期和生存率密切相關(guān)，下調(diào)FAL1 可以抑制骨肉瘤的增殖、侵襲、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制骨肉瘤的進(jìn)展[21]。FAL1 可與PRC1 的BMI1 亞基結(jié)合，抑制靶基因p21 的啟動子，導(dǎo)致細(xì)胞周期失衡，加速卵巢癌進(jìn)展[22]。FAL1 作為“海綿”，與miR-1236 結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[23]。然而，F(xiàn)AL1 在胃癌中的作用尚不清楚。

STAT3 參與AK/STAT 通路的激活，該通路廣泛參與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[24]。Wu 等[25]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌IL-6，激活GC 細(xì)胞的JAK2/STAT3 信號通路，促進(jìn)GC 細(xì)胞的遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究發(fā)現(xiàn)，在抑制FAL1 的表達(dá)后，STAT3 的mRNA 和蛋白表達(dá)均下降。而且在下調(diào)FAL1 的表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力下降，凋亡增加；在此基礎(chǔ)上過表達(dá)STAT3，被削弱的惡性表型恢復(fù)，這提示FAL1 在GC中的促癌作用是通過STAT3 實現(xiàn)的。

綜述所述，lncRNA FAL1 和STAT3 協(xié)同作用，促進(jìn)GC 的惡性增殖，并抑制細(xì)胞凋亡，后續(xù)將在在體模型中對此進(jìn)行驗證，并探討STAT3 在GC 中的下游調(diào)控機制。