陳雪晴 劉雁錐 馮 靜 羅苑苑 李 姍

1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510040；2.廣東省遂溪縣人民醫(yī)院檢驗科，廣東遂溪 524300；3.河南大學附屬鄭州頤和醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南鄭州 450046；4.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣東廣州 510040；5.河南中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理學與病理生理學教研室，河南鄭州 450046

2019 年12 月以來，新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）在全球多個國家和地區(qū)肆虐，其傳播迅速、傳染性強，嚴重威脅著人們的健康，制約著社會經(jīng)濟的發(fā)展，已被世界衛(wèi)生組織列為全球性大流行病[1]。因此，尋求有效的治療藥物仍然是防疫工作的重點[2]。

炎癥反應是COVID-19 的主要病理機制之一。當機體感染病毒后，多種細胞因子激活并釋放，當細胞因子大量積聚，就會造成炎癥風暴，免疫調(diào)控失衡，患者病情惡化，出現(xiàn)呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克甚至器官功能衰竭[3]。炎癥風暴發(fā)病前征兆少，發(fā)病后救治難度大，雖然可以通過西藥來控制炎癥風暴，但藥物的毒副作用會使治療陷入進退兩難的境地[4]。中醫(yī)陰陽調(diào)和，辨證論治，從整體方面調(diào)控機體，已經(jīng)在COVID-19 的治療中彰顯出獨特的優(yōu)勢[5]。在我國COVID-19 確診病例中，中醫(yī)藥使用覆蓋率達91.5%，有效率達90%以上[6]。因此，對中醫(yī)藥抗COVID-19 的分子機制進行研究，有針對性地減輕炎癥風暴，對于防止病情惡化、改善疾病預后具有重要意義。

益氣化痰方由白術(shù)、黨參、茯苓、橘紅、半夏、枳實和甘草7 味中藥組成，是在四君子湯和六君子湯的基礎(chǔ)上加減變化而來。該方加重理氣化痰藥后，對于肺部疾病有很好的療效，特別是對于脾虛生濕，濕聚為痰的咳嗽、咳痰患者療效顯著。“脾為生痰之源，肺為貯痰之器”，用該方治療可一舉兩得。研究顯示，慢性阻塞性肺疾病肺脾氣虛型患者，益氣化痰方具有良好療效，但作用機制還有待于進一步研究[9]。《COVID-19診療方案（試行第八版）》[7]中提出，恢復期COVID-19存在肺脾氣虛證，其推薦處方與益氣化痰方有異曲同工之效。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學預測并篩選益氣化痰方的活性成分，探討其治療COVID-19 的分子機制，為該方的進一步研究和臨床應用提供藥理學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 益氣化痰方生物活性成分篩選

利用TCMSP（http：//tcmspw.com/）檢索益氣化痰方中藥成分，獲取所有中藥成分的生物化學信息，包括分子名稱、相對分子質(zhì)量、油水分配系數(shù)、類藥性質(zhì)（drug-like properties，DL）和口服生物利用度（oral bioavailability，OB）?；诮?jīng)典藥代動力學參數(shù)：吸收、分布、代謝、排泄進行篩選，確定以O(shè)B≥30%，及DL≥0.18 為初步篩選條件[8]。

1.2 益氣化痰方生物活性成分潛在靶點分析

將在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中獲取益氣化痰方活性成分的靶蛋白名稱輸入Uni-prot 數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）繪制相應的Gene Symbol。

1.3 藥物活性成分-靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將益氣化痰方藥物組成、對應活性成分及預測靶蛋白名導入Cytoscape 3.6.1 軟件中，構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖[9]。

1.4 構(gòu)建藥物與疾病交集基因圖

基于GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，以“Corona Virus Disease 2019”為關(guān)鍵詞進行檢索，與藥物潛在靶點共同導入Venny 2.1 平臺，構(gòu)建藥物治療疾病潛在基因圖。

1.5 靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將益氣化痰方與COVID-19 治療相關(guān)的共同靶點通過String 數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建靶標PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 GO 功能分析與KEGG 富集分析

將益氣化痰方治療COVID-19 的交集核心靶點導入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫進行基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析。選擇物種為智人，依據(jù)通用標準，設(shè)置篩選條件為：Count≥4，P ≤0.05，錯誤發(fā)現(xiàn)率≤0.05，得到生物過程富集和通路富集[10]。

2 結(jié)果

2.1 益氣化痰方活性成分篩選收集

初步篩選出145 個益氣化痰方活性成分，包括白術(shù)4 個，黨參17 個，茯苓6 個，橘紅7 個，半夏12 個，枳實19 個，甘草88 個，其中共有活性成分為7 個（MOL0 04328 成分重復計算一次）。見表1。

表1 益氣化痰方藥物組成的共有活性成分

2.2 益氣化痰方活性成分靶點預測

共得到藥物交互作用靶點267 個，并成功構(gòu)建藥物-活性成分-靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，得到421 個節(jié)點，2766 條邊，見圖1。圖中六邊形節(jié)點代表益氣化痰方藥物組成，倒三角形節(jié)點代表益氣化痰方主要活性成分，圓形節(jié)點代表藥物作用的潛在基因靶點。每條邊表示節(jié)點間的相互作用關(guān)系，一個節(jié)點與其他節(jié)點間的連線越多，代表其重要性越大，與其他的靶點聯(lián)系越密切。

圖1 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 益氣化痰方治療作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

共得到COVID-19 相關(guān)基因251 種。導入藥物與疾病的相關(guān)基因，取其交集，共得到56 個益氣化痰方治療COVID-19 的潛在靶點，見圖2。將56 個靶點導入String 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖獲得關(guān)聯(lián)靶蛋白55個，其中超過平均度值的靶蛋白有30 個，圖中節(jié)點大小與顏色和節(jié)點度值呈正比，見圖3。拓撲分析后篩選的關(guān)鍵靶點為MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、TP53、CASP3、FOS，見圖4。

圖2 益氣化痰方與COVID-19 靶點Venn 圖

圖3 益氣化痰方PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 益氣化痰方治療COVID-19 的網(wǎng)絡(luò)拓撲圖

2.4 GO 富集分析與KEGG 通路分析

GO 富集分析和KEGG 通路分析，獲得選擇72 個GO 富集條目，包含生物學過程（biological process，BP）57 個，分子功能（molecular function，MF）11 個，細胞組分（cellular component，CC）4 個，對前20 個生物學過程、分子功能和細胞組成進行可視化分析。結(jié)果顯示，益氣化痰方主要涉及藥物反應、炎癥反應、免疫應答等多個BP；主要包括蛋白質(zhì)結(jié)合、酶的結(jié)合和細胞因子活性等MF；并參與了胞質(zhì)、線粒體、細胞外空間、細胞外區(qū)域的組成，見圖5。KEGG 通路分析獲得25 條通路，主要富集于美洲錐蟲病、乙型肝炎、肺結(jié)核、百日咳、癌癥通路、TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、MAPK 信號通路，見圖6。

圖5 益氣化痰方治療COVID-19 的GO 分析

3 討論

在全國人民的共同努力下，我國的COVID-19 疫情已然得到很好的控制，但境外感染者的輸入和無癥狀感染者的存在，給疫情的防控帶來新的壓力和挑戰(zhàn)。中醫(yī)藥歷史悠久，傳承數(shù)載，在抗疫的關(guān)鍵時期發(fā)揮了顯著的療效。對中醫(yī)藥的進一步挖掘和開發(fā)能夠為COVID-19 的防治提供新的策略和思路。

臨床資料顯示，COVID-19 患者熱毒明顯，常見高熱持續(xù)不退、咳嗽頻作、痰多質(zhì)黏等癥狀[11]。益氣化痰方中黨參、白術(shù)補氣健脾，白術(shù)兼能燥濕，茯苓既可健脾，又能利水滲濕，三藥合用共奏健脾益肺，補益后天之功效[12]；半夏辛溫，善治臟腑濕痰；甘草，味甘，性平，具有補脾益氣，祛痰止咳，調(diào)和諸藥之功效[13-14]；加之橘紅、枳實理氣寬中，燥濕化痰。全方配伍嚴謹，具有健脾益氣、化痰祛濕的功效。從現(xiàn)代醫(yī)學角度，COVID-19 是由病毒感染引起的炎癥性疾病，抗炎、抗病毒是治療COVID-19 的重要措施。益氣化痰方中的7 味中藥均顯示了抗炎、抗感染或抗病毒功效[15-19]。經(jīng)活性物質(zhì)篩選發(fā)現(xiàn)，該方的有效成分主要有甾醇類化合物豆甾醇、β-谷甾醇、谷甾醇等，和黃酮類化合物柚皮素、木犀草素、香蜂草苷等。文獻報道，甾醇類化合物和黃酮類化合物具有廣泛的抗炎、抗病毒作用[20]。例如，豆甾醇、β-谷甾醇均能降低炎癥模型中巨噬細胞的活力和吞噬力，減少細胞因子一氧化氮、TNF-α 的生成[21]；柚皮素可改善大鼠腦出血后的炎癥損傷[22]，還具有抑制登革熱病毒復制的能力[23]；木犀草素可改變巨噬細胞M1/M2 的極化，通過下調(diào)p-STAT3 和上調(diào)p-STAT6 發(fā)揮抗炎作用[24]，還能抑制巨細胞病毒的復制發(fā)揮抗病毒作用[25]。

炎癥風暴在COVID-19 病情的惡化中起到了重要作用，是導致重癥、危重癥患者死亡的重要原因。炎癥風暴發(fā)病機制復雜，益氣化痰方多功能、多靶點、多途徑的獨特優(yōu)勢，有助于從源頭阻斷炎癥風暴的發(fā)生。益氣化痰方主要涉及炎癥反應、免疫應答、凋亡過程及凋亡正負調(diào)控等多個生物學過程，并且主要富集于美洲錐蟲病、乙型肝炎、肺結(jié)核、百日咳等感染性疾病及TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、MAPK 信號通路等多條通路。COVID-19 是感染性疾病，炎癥反應貫穿于疾病的始終，而TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、MAPK 信號通路中的關(guān)鍵分子可參與調(diào)控炎癥反應和免疫應答過程[26]。既往研究通過分子對接預測甘草與TNF 和PPARD 相關(guān)靶點蛋白具有較強的結(jié)合能力。Toll 樣受體信號通路作為天然免疫的重要組成部分，而網(wǎng)絡(luò)藥理學預測甘草與免疫相關(guān)受體具有較強的結(jié)合能力，在正向調(diào)控分子功能方面可能發(fā)揮關(guān)鍵作用[27]。益氣化痰方干預COVID-19 的關(guān)鍵靶點主要為絲裂原活化蛋白激酶家族成員（MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14）和細胞因子（IL-6、IL-10、TNF），MAPK 信號通路在炎癥細胞的增殖、分化和產(chǎn)生過程中起著關(guān)鍵的作用，并參與急性肺損傷的發(fā)生[28]。IL-6、IL-10 和TNF-α 參與肺部炎癥的發(fā)生發(fā)展，其中IL-10、TNF-α在COVID-19 重癥患者血清中顯著升高，可能是病情惡化的重要指標[29]，而IL-6更是誘發(fā)炎癥風暴的重要細胞因子[30]。研究表明，使用抗IL-6 受體的單抗類藥物有望緩解COVID-19 重癥患者的肺炎癥狀，降低疾病的死亡率[31]。本研究中益氣化痰方活性成分所含的柚皮素能通過抑制MAPK信號通路減少人支氣管上皮IL-6 的分泌，減輕脂多糖所誘導的支氣管上皮損傷[32]；所含的木犀草素則能抑制肺組織中IL-6 的表達，使膿毒癥小鼠急性肺損傷有所減輕[33]，提示益氣化痰方亦能減輕COVID所致的肺部炎癥和損傷，改善患者的臨床癥狀，防止炎癥風暴的發(fā)生。

綜上所述，本研究應用熱門的網(wǎng)絡(luò)藥理學進行預測分析，篩選出益氣化痰方的主要活性成分、潛在靶點及可能的作用機制，為該經(jīng)驗方應用于COVID-19的對癥治療提供了理論支持，也為傳統(tǒng)中醫(yī)藥的開發(fā)利用、合理配伍提供了科學參考。鑒于中藥復方起效緩慢，個體差異較大，對COVID-19 患者應盡早實施中醫(yī)藥干預治療，及時調(diào)整優(yōu)化治療方案，以期獲得最佳治療效果。本研究是對益氣化痰方用于治療COVID-19 可行性的理論數(shù)據(jù)分析，尚缺乏臨床用藥數(shù)據(jù)，預測的藥物有效成分及其作用靶點仍需進一步體內(nèi)外實驗驗證。