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        白駁丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

        2021-09-26 05:50:58陳占功趙小偉吳劍坤

        陳占功 趙小偉 吳劍坤 白 燕

        首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部,北京 100010

        白駁丸是北京市醫(yī)療機(jī)構(gòu)法定制劑[1],也是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”)皮膚科常用的院內(nèi)制劑(京藥制字Z20063335),其治療白癜風(fēng)效果確切[2]。白駁丸處方主要包含炒蒺藜、防風(fēng)、首烏藤、雞血藤、當(dāng)歸、紅花、赤芍、鹽補(bǔ)骨脂、黑豆、陳皮10 味藥,功效為補(bǔ)腎活血、散風(fēng)通絡(luò),用于血瘀腎虛,風(fēng)邪束表證,癥見(jiàn)頭暈、心悸、腰酸、畏寒,女性月經(jīng)量少,皮膚色素脫失或色素減退,舌質(zhì)淡,苔薄白,脈沉細(xì)、弦緊;白癜風(fēng)見(jiàn)上述證候者。原制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有2 項(xiàng)試管反應(yīng),專(zhuān)屬性差,無(wú)法控制白駁丸的質(zhì)量。我院作為白駁丸的使用單位,筆者研究起草了白駁丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),定性鑒別增加了蒺藜、防風(fēng)、雞血藤、紅花、黑豆的顯微鑒別和當(dāng)歸、首烏藤、赤芍的薄層色譜鑒別,鑒別藥味占處方藥味的80%;同時(shí)定量分析了異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂素的含量,以期全面反映和控制白駁丸的質(zhì)量,保障臨床療效。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器

        1260 高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent),DM2500 顯微鏡(德國(guó)Leica),十萬(wàn)分之一XS205 超越系列專(zhuān)業(yè)型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司),YOKO-ZS紫外線(xiàn)分析攝影儀(武漢藥科新技術(shù)開(kāi)發(fā)公司),SK7210HP 型超聲波清洗機(jī)(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

        1.2 試藥

        對(duì)照藥材:當(dāng)歸(120927-200613)、首烏藤(120939-200705)、陳皮(969-9302)來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院;對(duì)照品:芍藥苷(110736-200934)、異補(bǔ)骨脂素(110738-20313)、補(bǔ)骨脂素(110739-201617)來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院;硅膠G 板(青島海洋化工廠(chǎng));甲醇(20200201)、乙醚(20180621)、乙酸乙酯(20191201)、正己烷(20190527)、氯仿(20170616)、甲酸(F1914077)、香草醛(20060522)、濃硫酸(20180524)、乙醇(20200211),所用試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用藥材飲片由我院中藥房提供;白駁丸(1904073、1912022、2002026)來(lái)源于我院。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 顯微鑒別

        分別取白駁丸(1912022)適量,研磨成細(xì)粉,取少量透化后置10×40 倍顯微鏡下觀察。

        2.1.1 雞血藤 雞血藤的顯微特征有棕紅色色塊,石細(xì)胞及纖維束和草酸鈣方晶等。周?chē)”诩?xì)胞中含草酸鈣方晶,草酸鈣方晶呈類(lèi)雙錐形或不規(guī)則形,形成晶纖維[3-4],本研究以晶纖維為其鑒別特征。見(jiàn)圖1。

        圖1 晶纖維

        2.1.2 炒蒺藜 炒蒺藜為果實(shí)種子類(lèi)藥材,其木化的內(nèi)果皮纖維特征較為獨(dú)特。內(nèi)果皮纖維木化,上下層縱橫交錯(cuò)排列,作為蒺藜的鑒別特征[3-4]。見(jiàn)圖2。

        圖2 內(nèi)果皮纖維

        2.1.3 紅花 紅花為本方中唯一的花類(lèi)藥材,以花粉粒作為其鑒別特征?;ǚ哿>? 個(gè)萌發(fā)孔,外壁有齒狀突起,類(lèi)圓形、橢圓形或橄欖形,直徑60 μm 左右[3-4]。見(jiàn)圖3。

        圖3 花粉粒

        2.1.4 黑豆 黑豆的顯微特征是具有種皮珊狀細(xì)胞、種皮支持細(xì)胞、子葉細(xì)胞、草酸鈣結(jié)晶等。其中,種皮珊狀細(xì)胞紫紅色,側(cè)面觀細(xì)胞1 列,長(zhǎng)50~80 μm,壁厚,具光輝帶且較為顯著,本研究將種皮珊狀細(xì)胞作為其鑒別特征[3-4]。見(jiàn)圖4。

        圖4 種皮珊狀細(xì)胞

        2.1.5 防風(fēng) 防風(fēng)的顯微鑒別特征為具有油管、葉基維管束、網(wǎng)紋導(dǎo)管、石細(xì)胞等。其中,油管直徑17~60 μm,充滿(mǎn)金黃色分泌物[3-4],本研究以其作為防風(fēng)的鑒別特征。見(jiàn)圖5。

        圖5 油管

        2.2 薄層色譜法(thin layer chromatography,TLC)鑒別

        2.2.1 當(dāng)歸TLC 鑒別 取白駁丸(1912022)12 g,粉碎成細(xì)粉,加甲醇30 ml 后超聲提取40 min,過(guò)濾,得到的濾液揮盡溶劑,剩余殘?jiān)芙夂笠颐演腿? 次,合并乙醚層,揮盡溶劑,剩余殘?jiān)右宜嵋阴? ml 溶解,作為白駁丸供試液。取當(dāng)歸對(duì)照藥材1 g,按以上供試液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。另外,按白駁丸處方配比,取除去當(dāng)歸的其他藥材飲片,按白駁丸制法及供試液制法制成當(dāng)歸陰性對(duì)照液。依照《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版四部通則0502[5]收載的TLC進(jìn)行試驗(yàn),白駁丸供試液吸取10 μl,當(dāng)歸對(duì)照藥材溶液吸取3 μl,當(dāng)歸陰性對(duì)照溶液吸取5 μl,分別點(diǎn)于同一塊硅膠G 板上,采用正己烷-乙酸乙酯(4∶1)的展開(kāi)劑展開(kāi),取出后晾干,置于365 nm 的紫外光燈下檢視,結(jié)果可見(jiàn),在供試品色譜中,與當(dāng)歸對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置處可見(jiàn)相同顏色的熒光斑點(diǎn),當(dāng)歸陰性對(duì)照則沒(méi)有干擾[4-6]。見(jiàn)圖6。

        圖6 當(dāng)歸薄層色譜圖

        2.2.2 首烏藤TLC 鑒別 取首烏藤對(duì)照藥材1 g,同“2.2.1”項(xiàng)下供試液制法制備對(duì)照藥材溶液。另按白駁丸處方,取除去首烏藤的其他藥材飲片,按白駁丸制法及供試液制法制成首烏藤陰性對(duì)照液。按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版四部通則0502[5]收載的TLC 進(jìn)行試驗(yàn),吸取“2.2.1”項(xiàng)下白駁丸供試液5 μl、首烏藤對(duì)照藥材溶液3 μl、首烏藤陰性對(duì)照液5 μl,分別點(diǎn)于同一塊硅膠G 板上,采用正己烷-三氯甲烷-醋酸乙酯-甲酸(5∶5∶2∶0.1)展開(kāi),取出后晾干。置于365 nm 的紫外光燈下檢視,結(jié)果可見(jiàn),在供試品色譜中,與首烏藤對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置處有相同顏色的熒光斑點(diǎn),首烏藤陰性對(duì)照則沒(méi)有干擾[4-8]。見(jiàn)圖7。

        圖7 首烏藤薄層色譜圖

        2.2.3 赤芍TLC 鑒別 將“2.2.1”中乙醚提取過(guò)的水層揮盡乙醚后,采用醋酸乙酯振搖萃取2 次,合并上層的醋酸乙酯層,揮盡醋酸乙酯,殘?jiān)眉状? ml 溶解作為供試液。取芍藥苷對(duì)照品用甲醇制成每毫升含1 mg的對(duì)照品溶液。另按白駁丸處方,取除去赤芍的其他藥材飲片,按白駁丸制法及供試液制法制成赤芍陰性對(duì)照液。依照《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版四部通則0502[5]收載的TLC 進(jìn)行試驗(yàn),吸取白駁丸供試液5 μl、芍藥苷對(duì)照品溶液3 μl、赤芍陰性對(duì)照液5 μl,分別點(diǎn)于同一塊硅膠G 板上,采用三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)展開(kāi),取出后晾干,噴以5%香草醛濃硫酸的乙醇溶液,加熱至出現(xiàn)清晰斑點(diǎn),于日光下檢視,結(jié)果可見(jiàn),在供試品色譜中,與芍藥苷色譜相應(yīng)位置處有相同顏色的斑點(diǎn),赤芍陰性對(duì)照則沒(méi)有干擾[4-7]。見(jiàn)圖8。

        圖8 赤芍薄層色譜圖

        2.3 白駁丸中異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂素的含量測(cè)定

        2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(AgilentSB-C18,250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫40℃,流動(dòng)相采用甲醇-水(55∶45);檢測(cè)波長(zhǎng)為246 nm[4-8]。

        2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取適量的異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂素對(duì)照品適量,用甲醇制成每1 ml 含異補(bǔ)骨脂素20.36 μg、補(bǔ)骨脂素20.44 μg 的混合溶液,即得對(duì)照品溶液。

        2.3.3 供試品溶液制備 取三批樣品1904073、1912022、2002026 各10 袋,粉碎成細(xì)粉,混合均勻,分別精密稱(chēng)定6 g,置索氏提取器中,精密加入甲醇適量,加熱回流提取2 h,冷卻后轉(zhuǎn)移至100 ml 量瓶中,用甲醇定容至100 ml,搖勻后過(guò)濾,所得濾液作為供試品溶液。

        2.3.4 陰性對(duì)照溶液制備 按白駁丸處方,取除去補(bǔ)骨脂的其他藥材飲片,按白駁丸的制備方法及供試品溶液制備方法制成補(bǔ)骨脂陰性對(duì)照溶液。

        2.3.5 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別精密吸取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液和補(bǔ)骨脂陰性對(duì)照溶液,按照“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件來(lái)測(cè)定,記錄色譜圖,結(jié)果見(jiàn)圖9??梢?jiàn)本實(shí)驗(yàn)采用的色譜條件下補(bǔ)骨脂陰性對(duì)照無(wú)干擾,專(zhuān)屬性強(qiáng)。

        圖9 補(bǔ)骨脂素及異補(bǔ)骨脂素的含量測(cè)定高效液相色譜法圖譜

        2.3.6 線(xiàn)性關(guān)系的考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1、3、6、9、12、15 μl,按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定各個(gè)峰面積,繼而以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),求得異補(bǔ)骨脂素回歸方程Y=4585.4X-25.979(r=0.9999),補(bǔ)骨脂素回歸方程Y=8387.5X-17.875(r=0.9999),表明異補(bǔ)骨脂素在0.0204~0.3054 μg 范圍內(nèi)、補(bǔ)骨脂素在0.0204~0.3066 μg 范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積積分值具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

        2.3.7 精密度試驗(yàn) 混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣10 μl,連續(xù)6 次,測(cè)定峰面積,結(jié)果補(bǔ)骨脂素峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)值為0.35%,異補(bǔ)骨脂素峰面積RSD 值為0.44%,表明所用儀器具有良好的精密度。

        2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(1912022)10 μl,分別于0、2、4、6、8 h 進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,計(jì)算補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD 值為1.71%,異補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD 值為1.64%,表明供試品溶液在8 h 內(nèi)具有良好穩(wěn)定性。

        2.3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取6 份同一批號(hào)的白駁丸樣品(1912022),分別采用“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備白駁丸供試品溶液,采用“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定,進(jìn)樣量為10 μl,測(cè)得峰面積值并計(jì)算異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂素含量,結(jié)果異補(bǔ)骨脂素含量RSD 值為1.26%,補(bǔ)骨脂素含量RSD 值為1.78%,重復(fù)性試驗(yàn)符合要求。

        2.3.10 回收率試驗(yàn) ①對(duì)照品溶液制備:分別精密稱(chēng)取異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品10.18 mg、補(bǔ)骨脂素對(duì)照品10.22 mg,放置于同一個(gè)50 ml 的量瓶中,采用甲醇定容,制成異補(bǔ)骨脂素0.2036 mg/ml、含補(bǔ)骨脂素0.2044 mg/ml 的溶液,即得。②樣品溶液制備:精密稱(chēng)取6 份已知含量的同一批號(hào)白駁丸樣品(1912022),分別加入補(bǔ)骨脂素1 ml,異補(bǔ)骨脂素4 ml,其余步驟按照“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行操作,采用“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算加樣回收率。見(jiàn)表1~2。

        表1 補(bǔ)骨脂素回收率

        表2 異補(bǔ)骨脂素回收率

        2.3.11 樣品測(cè)定 取3 個(gè)批號(hào)的白駁丸樣品,采用“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制得供試品溶液,采用“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣10 μl,測(cè)定異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂素的峰面積,計(jì)算其含量。見(jiàn)表3。

        表3 三批白駁丸含量測(cè)定結(jié)果(mg/g)

        3 討論

        白駁丸的生產(chǎn)工藝為藥材細(xì)粉用水制成水丸;而中藥粉末的專(zhuān)屬性鑒別方法即為顯微鑒別,不僅專(zhuān)屬性強(qiáng),更具有檢測(cè)成本低、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。因此,本研究利用顯微鑒別法鑒別了雞血藤藥材的晶纖維、蒺藜藥材內(nèi)果皮的木化纖維、紅花藥材的花粉粒、黑豆藥材具有光輝帶的紫紅色種皮珊狀細(xì)胞及防風(fēng)藥材充滿(mǎn)金黃色分泌物的油管,這些顯微特征易于觀察且專(zhuān)屬性強(qiáng)。當(dāng)歸、首烏藤的TLC 鑒別以乙醚提取物作為供試品,鑒別其弱極性成分,在365 nm 紫外光燈下熒光斑點(diǎn)清晰,陰性均無(wú)干擾。赤芍的TLC 鑒別以芍藥苷作為對(duì)照,顯色后日光下檢視,供試品色譜在相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn),陰性無(wú)干擾,重現(xiàn)性好。

        白癜風(fēng)是一種皮膚黏膜色素脫失性皮膚病[10],具有原發(fā)性、局限性或泛發(fā)性,表現(xiàn)為皮膚、黏膜、毛發(fā)等的黑色素細(xì)胞出現(xiàn)選擇性減少甚至消失從而引發(fā)白斑、灰發(fā)或白發(fā)[11],膚色深的人群比膚色淺的發(fā)病率高,我國(guó)人群患病率為0.1%~2.0%[12]。白癜風(fēng)在祖國(guó)醫(yī)學(xué)古籍中多有記載,古今同名,且中西醫(yī)病名相同[13]。目前,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)還未形成較為理想的治療白癜風(fēng)的方法,而祖國(guó)醫(yī)學(xué)近年來(lái)對(duì)于本病的治療取得滿(mǎn)意效果[14]。大部分醫(yī)家都是在辨證論治的基礎(chǔ)上,借鑒現(xiàn)代藥理學(xué)研究的成果,以增強(qiáng)療效[15]。目前中醫(yī)對(duì)白癜風(fēng)的病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)中,多數(shù)認(rèn)為白癜風(fēng)是由機(jī)體內(nèi)因與外因相互作用導(dǎo)致的。外因主要是風(fēng)邪外侵,內(nèi)因是由情志內(nèi)傷、肝氣郁結(jié)、氣機(jī)不暢,心火肺熱或脾胃虛弱、肝腎不足等臟腑失調(diào),導(dǎo)致皮膚氣血失和,瘀阻脈絡(luò)[16],歐陽(yáng)恒認(rèn)為發(fā)病機(jī)制為“氣血失和,久病成瘀”[17-18]。白駁丸具有散風(fēng)活血、補(bǔ)腎通絡(luò)之功,臨床應(yīng)用多年,療效確切。補(bǔ)骨脂具有溫腎助陽(yáng)之功,為治療白癜風(fēng)的主要藥物[19],黃曼萍等[20]通過(guò)查閱文獻(xiàn)采集264 首治療白癜風(fēng)的外用處方,從白癜風(fēng)外用藥物頻次統(tǒng)計(jì)來(lái)講,補(bǔ)骨脂位列第一[21],補(bǔ)骨脂顏色為深色,中藥色象理論是在辨證理論的基礎(chǔ)上加入了以色治色的思想[22]。在白癜風(fēng)的治療中能夠促進(jìn)黑色素細(xì)胞的遷移和黑色素合成[23-24],補(bǔ)骨脂中所包含活性成分種類(lèi)比較多,現(xiàn)已能夠分離出一些化合物[25-26]。補(bǔ)骨脂素屬于天然的呋喃香豆素類(lèi)化合物,在抗腫瘤、抗病毒、治療白血病、治療白癜風(fēng)皮膚頑疾等多方面的臨床應(yīng)用廣泛[27]。

        白駁丸治療白癜風(fēng),臨床應(yīng)用多年。本文選擇其主要成分補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素進(jìn)行含量測(cè)定,方法學(xué)考察結(jié)果符合要求,方法簡(jiǎn)便易行,專(zhuān)屬性良好,為臨床用藥提供質(zhì)量保證。

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