陳占功 趙小偉 吳劍坤 白 燕

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100010

白駁丸是北京市醫(yī)療機(jī)構(gòu)法定制劑[1]，也是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）皮膚科常用的院內(nèi)制劑（京藥制字Z20063335），其治療白癜風(fēng)效果確切[2]。白駁丸處方主要包含炒蒺藜、防風(fēng)、首烏藤、雞血藤、當(dāng)歸、紅花、赤芍、鹽補(bǔ)骨脂、黑豆、陳皮10 味藥，功效為補(bǔ)腎活血、散風(fēng)通絡(luò)，用于血瘀腎虛，風(fēng)邪束表證，癥見(jiàn)頭暈、心悸、腰酸、畏寒，女性月經(jīng)量少，皮膚色素脫失或色素減退，舌質(zhì)淡，苔薄白，脈沉細(xì)、弦緊；白癜風(fēng)見(jiàn)上述證候者。原制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有2 項(xiàng)試管反應(yīng)，專(zhuān)屬性差，無(wú)法控制白駁丸的質(zhì)量。我院作為白駁丸的使用單位，筆者研究起草了白駁丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，定性鑒別增加了蒺藜、防風(fēng)、雞血藤、紅花、黑豆的顯微鑒別和當(dāng)歸、首烏藤、赤芍的薄層色譜鑒別，鑒別藥味占處方藥味的80%；同時(shí)定量分析了異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂素的含量，以期全面反映和控制白駁丸的質(zhì)量，保障臨床療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent），DM2500 顯微鏡（德國(guó)Leica），十萬(wàn)分之一XS205 超越系列專(zhuān)業(yè)型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），YOKO-ZS紫外線(xiàn)分析攝影儀（武漢藥科新技術(shù)開(kāi)發(fā)公司），SK7210HP 型超聲波清洗機(jī)（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照藥材：當(dāng)歸（120927-200613）、首烏藤（120939-200705）、陳皮（969-9302）來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品：芍藥苷（110736-200934）、異補(bǔ)骨脂素（110738-20313）、補(bǔ)骨脂素（110739-201617）來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；硅膠G 板（青島海洋化工廠(chǎng)）；甲醇（20200201）、乙醚（20180621）、乙酸乙酯（20191201）、正己烷（20190527）、氯仿（20170616）、甲酸（F1914077）、香草醛（20060522）、濃硫酸（20180524）、乙醇（20200211），所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用藥材飲片由我院中藥房提供；白駁丸（1904073、1912022、2002026）來(lái)源于我院。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

分別取白駁丸（1912022）適量，研磨成細(xì)粉，取少量透化后置10×40 倍顯微鏡下觀察。

2.1.1 雞血藤 雞血藤的顯微特征有棕紅色色塊，石細(xì)胞及纖維束和草酸鈣方晶等。周?chē)”诩?xì)胞中含草酸鈣方晶，草酸鈣方晶呈類(lèi)雙錐形或不規(guī)則形，形成晶纖維[3-4]，本研究以晶纖維為其鑒別特征。見(jiàn)圖1。

圖1 晶纖維

2.1.2 炒蒺藜 炒蒺藜為果實(shí)種子類(lèi)藥材，其木化的內(nèi)果皮纖維特征較為獨(dú)特。內(nèi)果皮纖維木化，上下層縱橫交錯(cuò)排列，作為蒺藜的鑒別特征[3-4]。見(jiàn)圖2。

圖2 內(nèi)果皮纖維

2.1.3 紅花 紅花為本方中唯一的花類(lèi)藥材，以花粉粒作為其鑒別特征?；ǚ哿＞? 個(gè)萌發(fā)孔，外壁有齒狀突起，類(lèi)圓形、橢圓形或橄欖形，直徑60 μm 左右[3-4]。見(jiàn)圖3。

圖3 花粉粒

2.1.4 黑豆 黑豆的顯微特征是具有種皮珊狀細(xì)胞、種皮支持細(xì)胞、子葉細(xì)胞、草酸鈣結(jié)晶等。其中，種皮珊狀細(xì)胞紫紅色，側(cè)面觀細(xì)胞1 列，長(zhǎng)50～80 μm，壁厚，具光輝帶且較為顯著，本研究將種皮珊狀細(xì)胞作為其鑒別特征[3-4]。見(jiàn)圖4。

圖4 種皮珊狀細(xì)胞

2.1.5 防風(fēng) 防風(fēng)的顯微鑒別特征為具有油管、葉基維管束、網(wǎng)紋導(dǎo)管、石細(xì)胞等。其中，油管直徑17～60 μm，充滿(mǎn)金黃色分泌物[3-4]，本研究以其作為防風(fēng)的鑒別特征。見(jiàn)圖5。

圖5 油管

2.2 薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）鑒別

2.2.1 當(dāng)歸TLC 鑒別 取白駁丸（1912022）12 g，粉碎成細(xì)粉，加甲醇30 ml 后超聲提取40 min，過(guò)濾，得到的濾液揮盡溶劑，剩余殘?jiān)芙夂笠颐演腿? 次，合并乙醚層，揮盡溶劑，剩余殘?jiān)右宜嵋阴? ml 溶解，作為白駁丸供試液。取當(dāng)歸對(duì)照藥材1 g，按以上供試液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。另外，按白駁丸處方配比，取除去當(dāng)歸的其他藥材飲片，按白駁丸制法及供試液制法制成當(dāng)歸陰性對(duì)照液。依照《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版四部通則0502[5]收載的TLC進(jìn)行試驗(yàn)，白駁丸供試液吸取10 μl，當(dāng)歸對(duì)照藥材溶液吸取3 μl，當(dāng)歸陰性對(duì)照溶液吸取5 μl，分別點(diǎn)于同一塊硅膠G 板上，采用正己烷-乙酸乙酯（4∶1）的展開(kāi)劑展開(kāi)，取出后晾干，置于365 nm 的紫外光燈下檢視，結(jié)果可見(jiàn)，在供試品色譜中，與當(dāng)歸對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置處可見(jiàn)相同顏色的熒光斑點(diǎn)，當(dāng)歸陰性對(duì)照則沒(méi)有干擾[4-6]。見(jiàn)圖6。

圖6 當(dāng)歸薄層色譜圖

2.2.2 首烏藤TLC 鑒別 取首烏藤對(duì)照藥材1 g，同“2.2.1”項(xiàng)下供試液制法制備對(duì)照藥材溶液。另按白駁丸處方，取除去首烏藤的其他藥材飲片，按白駁丸制法及供試液制法制成首烏藤陰性對(duì)照液。按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版四部通則0502[5]收載的TLC 進(jìn)行試驗(yàn)，吸取“2.2.1”項(xiàng)下白駁丸供試液5 μl、首烏藤對(duì)照藥材溶液3 μl、首烏藤陰性對(duì)照液5 μl，分別點(diǎn)于同一塊硅膠G 板上，采用正己烷-三氯甲烷-醋酸乙酯-甲酸（5∶5∶2∶0.1）展開(kāi)，取出后晾干。置于365 nm 的紫外光燈下檢視，結(jié)果可見(jiàn)，在供試品色譜中，與首烏藤對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置處有相同顏色的熒光斑點(diǎn)，首烏藤陰性對(duì)照則沒(méi)有干擾[4-8]。見(jiàn)圖7。

圖7 首烏藤薄層色譜圖

2.2.3 赤芍TLC 鑒別 將“2.2.1”中乙醚提取過(guò)的水層揮盡乙醚后，采用醋酸乙酯振搖萃取2 次，合并上層的醋酸乙酯層，揮盡醋酸乙酯，殘?jiān)眉状? ml 溶解作為供試液。取芍藥苷對(duì)照品用甲醇制成每毫升含1 mg的對(duì)照品溶液。另按白駁丸處方，取除去赤芍的其他藥材飲片，按白駁丸制法及供試液制法制成赤芍陰性對(duì)照液。依照《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版四部通則0502[5]收載的TLC 進(jìn)行試驗(yàn)，吸取白駁丸供試液5 μl、芍藥苷對(duì)照品溶液3 μl、赤芍陰性對(duì)照液5 μl，分別點(diǎn)于同一塊硅膠G 板上，采用三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）展開(kāi)，取出后晾干，噴以5%香草醛濃硫酸的乙醇溶液，加熱至出現(xiàn)清晰斑點(diǎn)，于日光下檢視，結(jié)果可見(jiàn)，在供試品色譜中，與芍藥苷色譜相應(yīng)位置處有相同顏色的斑點(diǎn)，赤芍陰性對(duì)照則沒(méi)有干擾[4-7]。見(jiàn)圖8。

圖8 赤芍薄層色譜圖

2.3 白駁丸中異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂素的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（AgilentSB-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫40℃，流動(dòng)相采用甲醇-水（55∶45）；檢測(cè)波長(zhǎng)為246 nm[4-8]。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取適量的異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂素對(duì)照品適量，用甲醇制成每1 ml 含異補(bǔ)骨脂素20.36 μg、補(bǔ)骨脂素20.44 μg 的混合溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 取三批樣品1904073、1912022、2002026 各10 袋，粉碎成細(xì)粉，混合均勻，分別精密稱(chēng)定6 g，置索氏提取器中，精密加入甲醇適量，加熱回流提取2 h，冷卻后轉(zhuǎn)移至100 ml 量瓶中，用甲醇定容至100 ml，搖勻后過(guò)濾，所得濾液作為供試品溶液。

2.3.4 陰性對(duì)照溶液制備 按白駁丸處方，取除去補(bǔ)骨脂的其他藥材飲片，按白駁丸的制備方法及供試品溶液制備方法制成補(bǔ)骨脂陰性對(duì)照溶液。

2.3.5 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別精密吸取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液和補(bǔ)骨脂陰性對(duì)照溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件來(lái)測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖9?？梢?jiàn)本實(shí)驗(yàn)采用的色譜條件下補(bǔ)骨脂陰性對(duì)照無(wú)干擾，專(zhuān)屬性強(qiáng)。

圖9 補(bǔ)骨脂素及異補(bǔ)骨脂素的含量測(cè)定高效液相色譜法圖譜

2.3.6 線(xiàn)性關(guān)系的考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1、3、6、9、12、15 μl，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定各個(gè)峰面積，繼而以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），求得異補(bǔ)骨脂素回歸方程Y=4585.4X-25.979（r=0.9999），補(bǔ)骨脂素回歸方程Y=8387.5X-17.875（r=0.9999），表明異補(bǔ)骨脂素在0.0204～0.3054 μg 范圍內(nèi)、補(bǔ)骨脂素在0.0204～0.3066 μg 范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積積分值具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣10 μl，連續(xù)6 次，測(cè)定峰面積，結(jié)果補(bǔ)骨脂素峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值為0.35%，異補(bǔ)骨脂素峰面積RSD 值為0.44%，表明所用儀器具有良好的精密度。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（1912022）10 μl，分別于0、2、4、6、8 h 進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD 值為1.71%，異補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD 值為1.64%，表明供試品溶液在8 h 內(nèi)具有良好穩(wěn)定性。

2.3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取6 份同一批號(hào)的白駁丸樣品（1912022），分別采用“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備白駁丸供試品溶液，采用“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μl，測(cè)得峰面積值并計(jì)算異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂素含量，結(jié)果異補(bǔ)骨脂素含量RSD 值為1.26%，補(bǔ)骨脂素含量RSD 值為1.78%，重復(fù)性試驗(yàn)符合要求。

2.3.10 回收率試驗(yàn) ①對(duì)照品溶液制備：分別精密稱(chēng)取異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品10.18 mg、補(bǔ)骨脂素對(duì)照品10.22 mg，放置于同一個(gè)50 ml 的量瓶中，采用甲醇定容，制成異補(bǔ)骨脂素0.2036 mg/ml、含補(bǔ)骨脂素0.2044 mg/ml 的溶液，即得。②樣品溶液制備：精密稱(chēng)取6 份已知含量的同一批號(hào)白駁丸樣品（1912022），分別加入補(bǔ)骨脂素1 ml，異補(bǔ)骨脂素4 ml，其余步驟按照“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行操作，采用“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。見(jiàn)表1～2。

表1 補(bǔ)骨脂素回收率

表2 異補(bǔ)骨脂素回收率

2.3.11 樣品測(cè)定 取3 個(gè)批號(hào)的白駁丸樣品，采用“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，采用“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣10 μl，測(cè)定異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂素的峰面積，計(jì)算其含量。見(jiàn)表3。

表3 三批白駁丸含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

3 討論

白駁丸的生產(chǎn)工藝為藥材細(xì)粉用水制成水丸；而中藥粉末的專(zhuān)屬性鑒別方法即為顯微鑒別，不僅專(zhuān)屬性強(qiáng)，更具有檢測(cè)成本低、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。因此，本研究利用顯微鑒別法鑒別了雞血藤藥材的晶纖維、蒺藜藥材內(nèi)果皮的木化纖維、紅花藥材的花粉粒、黑豆藥材具有光輝帶的紫紅色種皮珊狀細(xì)胞及防風(fēng)藥材充滿(mǎn)金黃色分泌物的油管，這些顯微特征易于觀察且專(zhuān)屬性強(qiáng)。當(dāng)歸、首烏藤的TLC 鑒別以乙醚提取物作為供試品，鑒別其弱極性成分，在365 nm 紫外光燈下熒光斑點(diǎn)清晰，陰性均無(wú)干擾。赤芍的TLC 鑒別以芍藥苷作為對(duì)照，顯色后日光下檢視，供試品色譜在相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾，重現(xiàn)性好。

白癜風(fēng)是一種皮膚黏膜色素脫失性皮膚病[10]，具有原發(fā)性、局限性或泛發(fā)性，表現(xiàn)為皮膚、黏膜、毛發(fā)等的黑色素細(xì)胞出現(xiàn)選擇性減少甚至消失從而引發(fā)白斑、灰發(fā)或白發(fā)[11]，膚色深的人群比膚色淺的發(fā)病率高，我國(guó)人群患病率為0.1%～2.0%[12]。白癜風(fēng)在祖國(guó)醫(yī)學(xué)古籍中多有記載，古今同名，且中西醫(yī)病名相同[13]。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)還未形成較為理想的治療白癜風(fēng)的方法，而祖國(guó)醫(yī)學(xué)近年來(lái)對(duì)于本病的治療取得滿(mǎn)意效果[14]。大部分醫(yī)家都是在辨證論治的基礎(chǔ)上，借鑒現(xiàn)代藥理學(xué)研究的成果，以增強(qiáng)療效[15]。目前中醫(yī)對(duì)白癜風(fēng)的病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)中，多數(shù)認(rèn)為白癜風(fēng)是由機(jī)體內(nèi)因與外因相互作用導(dǎo)致的。外因主要是風(fēng)邪外侵，內(nèi)因是由情志內(nèi)傷、肝氣郁結(jié)、氣機(jī)不暢，心火肺熱或脾胃虛弱、肝腎不足等臟腑失調(diào)，導(dǎo)致皮膚氣血失和，瘀阻脈絡(luò)[16]，歐陽(yáng)恒認(rèn)為發(fā)病機(jī)制為“氣血失和，久病成瘀”[17-18]。白駁丸具有散風(fēng)活血、補(bǔ)腎通絡(luò)之功，臨床應(yīng)用多年，療效確切。補(bǔ)骨脂具有溫腎助陽(yáng)之功，為治療白癜風(fēng)的主要藥物[19]，黃曼萍等[20]通過(guò)查閱文獻(xiàn)采集264 首治療白癜風(fēng)的外用處方，從白癜風(fēng)外用藥物頻次統(tǒng)計(jì)來(lái)講，補(bǔ)骨脂位列第一[21]，補(bǔ)骨脂顏色為深色，中藥色象理論是在辨證理論的基礎(chǔ)上加入了以色治色的思想[22]。在白癜風(fēng)的治療中能夠促進(jìn)黑色素細(xì)胞的遷移和黑色素合成[23-24]，補(bǔ)骨脂中所包含活性成分種類(lèi)比較多，現(xiàn)已能夠分離出一些化合物[25-26]。補(bǔ)骨脂素屬于天然的呋喃香豆素類(lèi)化合物，在抗腫瘤、抗病毒、治療白血病、治療白癜風(fēng)皮膚頑疾等多方面的臨床應(yīng)用廣泛[27]。

白駁丸治療白癜風(fēng)，臨床應(yīng)用多年。本文選擇其主要成分補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素進(jìn)行含量測(cè)定，方法學(xué)考察結(jié)果符合要求，方法簡(jiǎn)便易行，專(zhuān)屬性良好，為臨床用藥提供質(zhì)量保證。