農(nóng)雪萍

江西省胸科醫(yī)院病理科，江西南昌 330006

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤，具有較高的病發(fā)率與病死率，發(fā)病機(jī)制主要與患者吸煙、工作環(huán)境及遺傳等因素有關(guān)，常表現(xiàn)為胸部疼痛、痰血、咳嗽、低熱與呼吸困難等，而非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占80%，術(shù)后5年生存率較低，即使是Ⅰ期患者接受腫瘤完全切除術(shù)治療后，仍有部分患者會在術(shù)后復(fù)發(fā)，而微轉(zhuǎn)移是造成患者易反復(fù)與轉(zhuǎn)移的預(yù)后指征，但該情況很難用臨床常規(guī)病理學(xué)檢測確診，常隱匿在原病灶之外的組織中[1]。逆轉(zhuǎn)錄聚合鏈反應(yīng)（reverse transcription polymer chain reaction，RTPCR）技術(shù)對腫瘤細(xì)胞有較高的靈敏度，可在10 個單個核細(xì)胞中準(zhǔn)確檢測出腫瘤細(xì)胞，是臨床實(shí)體瘤完整性中微轉(zhuǎn)移的常用措施[2-3]。本研究以RT-PCR 技術(shù)檢測外周血細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK19）、肺特異性X基因（lung-specific X gene，LUNX）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）mRNA 表達(dá)情況，探究其對NSCLC 患者早期轉(zhuǎn)移的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取江西省胸科醫(yī)院病理科2019年1月—2020年11月收治的52 例NSCLC 患者，術(shù)前均進(jìn)行抗腫瘤治療，排除患有其他惡性腫瘤或其他腫瘤肺部轉(zhuǎn)移者，均經(jīng)臨床病理學(xué)組織確診。其中男28 例，女24例；年齡32～75 歲，平均（52.31±3.22）歲；經(jīng)胸片、胸部CT掃描、B 超等檢查進(jìn)行臨床分期判定：Ⅰ期17 例，Ⅱ期21 例，Ⅲ期14 例。以同時期入院體檢的30 例正常體檢者作為參照組，其中男16 例，女14 例；年齡30～68歲，平均（52.66±3.56）歲。兩組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。參與者均知情并簽署同意書，且本研究已經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

于治療前抽取肺癌患者與正常體檢者的靜脈血5 mL，以淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司）將有核細(xì)胞分離，清洗后，離心（離心半徑為10 cm，離心轉(zhuǎn)速為3000 r/min，離心時間為15 min）取上清液；保存在1.5 mL 無菌Ep 管中，然后加入1000 μL Trizol（Invitrogen 公司）消化，經(jīng)氯仿抽提，異丙醇沉淀總RNA，經(jīng)75%乙醇漂洗，氣干后加入15 μL 無菌DEPC 水將其溶解，行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（嚴(yán)格遵循說明書操作）。

1.3 觀察指標(biāo)

記錄兩組外周血CK19、LUNX、CEA mRNA 表達(dá)陽性率，具體測量方法：將10 μL PCR 產(chǎn)物與β-actin PCR 產(chǎn)物、1.7 μL 澳酚上樣緩沖液混勻，將其加入1.5%瓊脂糖凝膠上，以100 bp Ladder Marker 加樣，然后將其作為分子量標(biāo)志；保持恒壓80 V，電泳40 min，行EB 染色，于UVB 凝膠成像系統(tǒng)下攝片，測量各條帶熒光強(qiáng)度。并分析細(xì)胞分化程度、TNM 分期與NSCLC患者各項(xiàng)外周血腫瘤標(biāo)志物mRNA 表達(dá)的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)數(shù)資料采用率表示，多組間率的整體比較采用χ2檢驗(yàn)，多組間率的兩兩比較采用Bonferroni 方法矯正，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=原α水平/比較次數(shù)，即0.05/3=0.0167。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血CK19、LUNX、CEA mRNA 表達(dá)陽性率的比較

NSCLC 組外周血CK19、LUNX、CEA mRNA 表達(dá)陽性率均高于參照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組外周血CK19、LUNX、CEA mRNA 表達(dá)陽性率的比較[n（%）]

2.2 細(xì)胞分化程度與NSCLC 患者各項(xiàng)外周血腫瘤標(biāo)志物mRNA 表達(dá)的關(guān)系

三種分化程度的CK19 mRNA 陽性率、CEAmRNA 陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高分化程度的LUNX mRNA 陽性率低于中、低分化程度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0167）；而中、低分化程度的LUNX mRNA 陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.0167）（表2）。

表2 細(xì)胞分化程度與NSCLC 患者各項(xiàng)外周血腫瘤標(biāo)志物mRNA表達(dá)的關(guān)系[n（%）]

2.3 TNM 分期與NSCLC 患者各項(xiàng)外周血腫瘤標(biāo)志物mRNA 表達(dá)的關(guān)系

三種TNM 分期的CK19 mRNA 陽性率、CEA mRNA 陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Ⅲ期的LUNX mRNA 陽性率高于Ⅰ期、Ⅱ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0167）；而Ⅰ期、Ⅱ期的LUNX mRNA 陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.0167）（表3）。

表3 TNM 分期與NSCLC 患者各項(xiàng)外周血腫瘤標(biāo)志物mRNA 表達(dá)的關(guān)系[n（%）]

3 討論

肺癌是目前臨床常見的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率，且大部分患者為NSCLC。近年來隨著臨床醫(yī)療技術(shù)與腫瘤疾病的深入研究，于早期與中期實(shí)施肺癌手術(shù)切除，可有效改善患者病情，且成功率較高，但患者5年的生存率總徘徊在20%左右[4-5]。有數(shù)據(jù)表明，NSCLC 患者預(yù)后的改善，與其腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[6-7]。而腫瘤轉(zhuǎn)移需多個步驟，主要是經(jīng)血液循環(huán)與淋巴循環(huán)進(jìn)行轉(zhuǎn)移，屬于惡性腫瘤的發(fā)展過程，可播散并存在患者的血液、淋巴、骨髓與各組織器官中，且尚未形成的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)無明顯臨床特征，經(jīng)常規(guī)的病理學(xué)與影像學(xué)等方法檢測很難發(fā)現(xiàn)[8-9]。目前臨床針對肺癌轉(zhuǎn)移情況主要以影像學(xué)檢查與病理學(xué)檢查為主，但效果并不理想。因癌細(xì)胞可能是患者術(shù)后腫瘤全身轉(zhuǎn)移的根源，其外周血中的癌細(xì)胞則預(yù)示腫瘤具有轉(zhuǎn)移傾向，是表明患者腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的重要表現(xiàn)[10-11]。目前臨床實(shí)施的外周血特異性腫瘤標(biāo)志物mRNA 表達(dá)檢測NSCIC 微轉(zhuǎn)移情況，具有較高的敏感性與特異性，其標(biāo)志物主要為CK19、CEA、LUNX 等[12-13]。

本研究以52 例NSCLC 患者為研究對象，以上述外周血特異性腫瘤標(biāo)志物mRNA 表達(dá)為指標(biāo)實(shí)施檢測，其中NSCLC 患者CK19、LUNX、CEA mRNA 的陽性率分別為38.46%、57.69%、44.23%，與參照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示若在患者外周血檢測到CK19、LUNX、CEA mRNA 表達(dá)，則表明患者體內(nèi)有完整的癌細(xì)胞存活。同時對不同分化程度的NSCLC 患者腫瘤標(biāo)志物mRNA 表達(dá)陽性率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，LUNX mRNA 陽性率隨分化程度升高而降低，高分化程度患者低于中、低分化患者（P＜0.0167），而三種分化程度的CK19 mRNA 陽性率、CEAmRNA 陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明LUNX mRNA 診斷效能優(yōu)于CK19、CEA mRNA。對不同分期的NSCLC 患者腫瘤標(biāo)志物mRNA 陽性率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)LUNX mRNA 陽性表達(dá)率隨著臨床分期的加重而增高，Ⅲ期的LUNX mRNA 陽性率高于Ⅰ、Ⅱ期（P＜0.0167），表明NSCLC 患者的分期愈晚，肺癌細(xì)胞脫落至血循環(huán)的危險性愈大。本研究結(jié)果證實(shí)，以LUNX mRNA 表達(dá)作為NSCLC 患者的微轉(zhuǎn)移提示指標(biāo)，可發(fā)揮顯著的敏感性與特異性。而肺癌患者外周血中LUNX mRNA 表達(dá)可能來自轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞，可準(zhǔn)確提示腫瘤的轉(zhuǎn)移傾向，解釋了臨床部分患者早期無任何轉(zhuǎn)移征象腫瘤，經(jīng)手術(shù)完整切除后仍會在短時間內(nèi)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。故LUNX mRNA 可作為NSCLC微轉(zhuǎn)移檢測的分子標(biāo)志物[14-15]。雖然微轉(zhuǎn)移是形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的必要條件，但有少量的腫瘤細(xì)胞檢出，并不代表最終會形成顯性轉(zhuǎn)移，其中腫瘤細(xì)胞自身生物學(xué)特性、局部微循環(huán)與機(jī)體免疫等情況均是重要的影響原因，若檢測出腫瘤細(xì)胞，則預(yù)示著患者有發(fā)生轉(zhuǎn)移的危險性。隨著臨床生命科學(xué)研究的不斷深入，分子生物學(xué)技術(shù)日益完善，再加上其他新興技術(shù)的推廣，必將會為腫瘤的深入研究提供可靠條件，因此在日后需深入探究NSCLC 外周血特異性腫瘤標(biāo)志物mRNA表達(dá)與微轉(zhuǎn)移的關(guān)系，對患者病程進(jìn)展、預(yù)后評估與臨床指導(dǎo)治療有重要意義。

綜上所述，肺癌患者微轉(zhuǎn)移的臨床意義需更深層次的論證，后期需對肺癌患者進(jìn)行密切隨訪，從而深入明確mRNA 陽性表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移、預(yù)后的關(guān)系。當(dāng)然臨床一次的檢測結(jié)果為陰性，并不代表患者無腫瘤微轉(zhuǎn)移情況，因腫瘤細(xì)胞可間斷的脫落進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，且在短時間內(nèi)會被機(jī)體的免疫系統(tǒng)破壞，故針對患者腫瘤細(xì)胞微轉(zhuǎn)移情況仍需多次反復(fù)檢測，從而提高診斷的準(zhǔn)確性與特異性。