李志慧 馮 龍 鄭文錦 孫 穎 夏金嬋 梅 雪 江 華 李曉娟

（河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，鄭州450046）

獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）是由人類免疫缺陷病毒（HIV）引起的傳染性疾病。HIV-1 進(jìn)入靶細(xì)胞需要兩種受體：主要受體CD4 和輔助受體CCR5（或CXCR4）[1］。輔助受體CCR5（或CXCR4）首先與CD4 分子結(jié)合，形成二聚復(fù)合體，然后HIV gp120 再與輔助受體結(jié)合，使其發(fā)生構(gòu)象改變，暴露gp41 位點(diǎn)，從而引發(fā)HIV 病毒包膜與靶細(xì)胞膜的融合[2-4］。趨化性細(xì)胞因子受體CCR5（CC-chemokine receptor 5，CCR5）作為嗜巨噬細(xì)胞性HIV-1 病毒的輔助受體，近年來備受關(guān)注。因此，干預(yù)CCR5 的啟動(dòng)子，阻斷HIV 早期感染，為防治艾滋病帶來了新希望。

姜黃素是從傳統(tǒng)中藥姜黃根莖中提取的活性成分，具有強(qiáng)大的抗腫瘤、抗炎、抗氧化功能[5］。近年研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以使慢性感染HIV-1和HSV-2的T細(xì)胞和原代人類生殖器上皮細(xì)胞的病毒復(fù)制顯著降低[6］。同時(shí)，姜黃素也是HIV 整合酶和蛋白酶的抑制劑[7］。因此，姜黃素的分子結(jié)構(gòu)可以作為抗HIV 新藥設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，具有開發(fā)潛力。但姜黃素抑制HIV 感染輔助受體CCR5 的確切機(jī)制仍然沒有探明，欠缺明確的科學(xué)證據(jù)。因此，本研究采用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)，以螢火蟲熒光素酶作為報(bào)告基因，用于反映CCR5 啟動(dòng)子的活性。載體下游重組入海腎熒光素酶（hRluc）基因，作為本底對照報(bào)告基因。通過序列分析，發(fā)現(xiàn)由于hRluc 單元具有兩個(gè)SV40 增強(qiáng)子，使hRluc 基因表達(dá)活性較強(qiáng)，削弱了上游螢火蟲熒光素酶的表達(dá)，使得雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體不能真實(shí)反映出上游CCR5 啟動(dòng)子的活性[8］。因此，本實(shí)驗(yàn)對雙報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，通過PCR 技術(shù)，擴(kuò)增出了保留hRluc 單元中SV40 部分片段的基因片段（命名該基因片段為Rluc）。將CCR5 啟動(dòng)子基因片段和Rluc 基因片段分別克隆入pGL4.10 表達(dá)載體，成功構(gòu)建重組載體pFireRluc-CCR5，提高了雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)的靈敏性和準(zhǔn)確性。將該重組載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，姜黃素對CCR5 啟動(dòng)活性的影響可以通過海腎熒光素酶與螢火蟲熒光素酶活性的比值表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過雙熒光素酶的比值反映出姜黃素對趨化因子受體CCR5啟動(dòng)子活性起到抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。姜黃素購自Sigma-Aldrich公司（批號(hào)：LRCOS107），用無水乙醇配制成10 μmol/L 的母液，使用時(shí)稀釋到所需濃度。質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、清潔試劑盒購自Axy-Gene 公 司（批 號(hào) 分 別 為08218KA1、25917KE1、33914KB1）；pGL4.10 質(zhì)粒、pGEM-T 載體、E1960 熒光檢測試劑盒均購自Promega 公司（批號(hào)分別為0000185341、0000172570、0000306998）；Cell Count‐ing Kit-8 細(xì)胞增殖-毒性測試試劑盒購自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司（批號(hào)：NN699）；引物合成及序列分析由上海生工生物工程有限公司完成；普通PCR 儀購自美國Labnet；隔水式恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏公司；低溫高速離心機(jī)購自德國Eppendorf；多功能微孔板測讀儀購自德國Berthold；酶標(biāo)儀及凝膠成像分析儀購自美國Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胚腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞培養(yǎng)于10% 胎牛血清和1% 青-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。每2～3 d更換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞達(dá)80%～90% 生長融合時(shí)，胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板、96孔板或培養(yǎng)瓶中用于實(shí)驗(yàn)研究及傳代。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 以pmir GLO 載體為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得Rluc 表達(dá)單元。以人基因組為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得CCR5 啟動(dòng)子表達(dá)單元，引物序列如表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.3 pFireRluc-CCR5 載體構(gòu)建 使用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建pFireRluc-CCR5表達(dá)載體：①PCR獲得目的基因片段：根據(jù)Rluc 基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)特異引物Rluc-F、Rluc-R，根據(jù)CCR5 啟動(dòng)子基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)特異引物CCR5-F、CCR5-R。抽取健康人血液，用血液基因組DNA 提取試劑盒提取人基因組模板，以人DNA 為模板PCR 擴(kuò)增出CCR5 啟動(dòng)子基因片段，以pmir GLO 載體為模板擴(kuò)增加出Rluc表達(dá)單元，如表1。 ②構(gòu)建重組載體pGEM-T-CCR5 和pGEM-T-Rluc：DNA 連接酶分別將CCR5 和Rluc 表達(dá)單元與pGEM-T 載體連接，獲得重組載體pGEMT-CCR5 和pGEM-T-Rluc，分別將其轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌DH5α，并進(jìn)行氨芐青霉素篩選。③構(gòu)建重組載體pFireRluc：用限制性內(nèi)切酶SalⅠ對pGEMT-Rluc和pGL4.10進(jìn)行單酶切，并對雙黏載體pGL4.10進(jìn)行去磷酸化處理，用T4 DNA 連接酶將Rluc 表達(dá)單元與磷酸化的pGL4.10 進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌DH5α。④酶切鑒定正反插入：挑選pFireRluc 陽性克隆，用StuⅠ、XbaⅠ雙酶切鑒定正反插入，若正向插入則送上海生工測序，測序正確獲得雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pFireRluc。⑤構(gòu)建重組載體pFireRluc-CCR5：用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和NheⅠ對pGEM-T-CCR5 和pFireRluc 進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA連接酶將CCR5表達(dá)單元與磷酸化的pFireRluc雙黏載體進(jìn)行連接獲得重組載體pFireRluc-CCR5，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌DH5α。挑選pFireRluc-CCR5 陽性克隆，送上海生工測序，測序正確獲得雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pFireRluc-CCR5。

1.2.4 CCK-8法測定姜黃素對293T細(xì)胞的毒性細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，制備5×104個(gè)/L的細(xì)胞懸液，接種于96 孔板中，每孔加入100 μl 細(xì)胞懸液，24 h 后加入含不同濃度姜黃素（10、20、40、60、80 μmol/L）的完全培養(yǎng)基（每孔設(shè)3 個(gè)復(fù)孔）。于加藥24 h 后進(jìn)行CCK-8 比色實(shí)驗(yàn)。每次于比色前1 h，每孔加入CCK-8 溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)1 h 后，在450 nm 處進(jìn)行吸光度OD 值測定。計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組抑 制 率（%）=OD（對照組?實(shí)驗(yàn)孔）/OD（對照孔?空白孔）×100%。 此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 根據(jù)CCK-8 檢測結(jié)果將293T 細(xì)胞分組：對照組（Control）為不轉(zhuǎn)染pFire-Rluc-CCR5 的293T 空細(xì)胞、無水乙醇對照組（Alco‐hol）、實(shí)驗(yàn)組（0、10、20、40、60、80 μmol/L 姜黃素）。轉(zhuǎn)染步驟參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染說明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前1 d 以3.6×105個(gè)/孔細(xì)胞接種于6 孔板，置于體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清（FBS）的細(xì)胞培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃常規(guī)培養(yǎng)。 細(xì)胞融合率達(dá)到60%～70% 時(shí)，用脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pFireRluc-CCR5 入293T 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6 h 后，更換體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清（FBS）的細(xì)胞培養(yǎng)基，加入一定濃度的姜黃素繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.6 雙熒光素酶活性的檢測 姜黃素作用于已轉(zhuǎn)染pFireRluc-CCR5 的293T 細(xì)胞，5%CO2、37℃常規(guī)培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說明書步驟操作，用Glomex20/20 檢測儀檢測各組細(xì)胞的海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶熒光值，每個(gè)藥物濃度分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)軟件，以單因素方差分析的方法，分析加藥實(shí)驗(yàn)組與對照組間差異是否具有顯著性，選取P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rluc 表達(dá)單元和CCR5 啟動(dòng)子表達(dá)單元擴(kuò)增結(jié)果 提取人基因組DNA 后，PCR 擴(kuò)增，膠回收獲得Rluc 和CCR5 啟動(dòng)子基因片段，電泳結(jié)果顯示：2000 bp及1000 bp處下側(cè)各見一條陽性條帶，與引物設(shè)計(jì)的目的片段Rluc和CCR5啟動(dòng)子的理論大小相對應(yīng)，表明Rluc 和CCR5 啟動(dòng)子的基因片段擴(kuò)增成功（圖1）。

圖1 重疊PCR得到Rluc表達(dá)單元和CCR5啟動(dòng)子表達(dá)單元Fig.1 Overlapping PCR to obtain Rluc and CCR5 pro?moter expression unit

2.2 pFireRluc-CCR5 重組載體的酶切鑒定結(jié)果核酸內(nèi)切酶酶切鑒定正反插入結(jié)果pFireRluc 重組載體大小為6239 bp，經(jīng)StuⅠ、XbaⅠ雙酶切，正向連接者產(chǎn)生5935 bp 和304 bp 兩個(gè)片段，如圖2 所示，證實(shí)pFireRluc 為正向插入克隆。測序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)克隆入載體的Rluc基因和CCR5啟動(dòng)子基因符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求，且無移碼突變和點(diǎn)突變，部分測序結(jié)果如圖3、4。

圖2 酶切后的pFireRluc-CCR5分子Fig.2 pFireRluc-CCR5 molecule after digestionNote：M.Marker；1.SalⅠdigestion result；2.StuⅠ，XbaⅠdouble enzyme digestion result.

圖3 Rluc表達(dá)單元的測序結(jié)果圖Fig.3 Sequencing results of Rluc expression unit

圖4 CCR5啟動(dòng)子表達(dá)單元的測序結(jié)果圖Fig.4 Sequencing results of CCR5 promotor expression unit

2.3 姜黃素對293T細(xì)胞的毒性作用 為了探究姜黃素對293T細(xì)胞活性的影響，采用CCK-8檢測細(xì)胞活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)姜黃素濃度低于80 μmol/L時(shí)，293T 細(xì)胞存活率維持在80% 以上，對293T 細(xì)胞的活性無明顯影響；當(dāng)濃度達(dá)到100 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞活性降至80% 以下（圖5）。因此，本研究選擇了對細(xì)胞無顯著毒性的10、20、40、60、80 μmol/L 劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 姜黃素對293T細(xì)胞活性的影響（n=3）Fig.5 Effect of curcumin on cell viability of 293T（n=3）

2.4 雙熒光素酶活性的檢測

2.4.1 pFireRluc-CCR5 雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體活性驗(yàn)證 沒有轉(zhuǎn)染pFireRluc-CCR5 重組質(zhì)粒的對照組（Control）與pFireRluc-CCR5轉(zhuǎn)染組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6 所示，說明pFireRluc-CCR5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，且所構(gòu)建載體具有活性。

圖6 pFireRluc-CCR5轉(zhuǎn)染對熒光素酶表達(dá)的影響Fig.6 Effect of pFireRluc-CCR5 transfection on lucifer?ase expression

2.4.2 姜黃素對CCR5 啟動(dòng)子活性的影響 為了進(jìn)一步檢驗(yàn)姜黃素對CCR5 啟動(dòng)子活性的影響，將轉(zhuǎn)染pFireRluc-CCR5 重組載體的293T 細(xì)胞，給予不同濃度的姜黃素處理24 h，測定各組熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，與0 μmol/L姜黃素處理組相比，無水乙醇對照組熒光強(qiáng)度無顯著變化，說明姜黃素溶劑無水乙醇對CCR5 啟動(dòng)子活性無明顯影響（P=0.9956）。且隨著姜黃素濃度的升高，CCR5啟動(dòng)子活性顯著降低推測姜黃素對CCR5 啟動(dòng)子活性具有抑制作用。

圖7 姜黃素對熒光素酶表達(dá)的影響Fig.7 Effect of curcumin on expression of luciferase

3 討論

HIV變異極其迅速，難以制備特異性疫苗，而現(xiàn)有抗HIV 藥物普遍存在毒副作用較大和易產(chǎn)生耐藥的問題[9］。目前艾滋病仍然是一項(xiàng)全球主要公共衛(wèi)生問題[10-11］。趨化性細(xì)胞因子受體CCR5 作為嗜巨噬細(xì)胞性HIV-1 病毒的輔助受體，近年來備受關(guān)注。因此，以CCR5 為靶點(diǎn)，阻斷HIV-1 早期感染，為防治艾滋病帶來了新希望。

姜黃的主要生物活性成分姜黃素，已被證明具有廣泛的生物活性，包括抗炎、抗細(xì)菌、抗真菌、抗原蟲、抗病毒等作用[12-14］。本研究發(fā)現(xiàn)：姜黃素能夠顯著降低趨化性細(xì)胞因子CCR5 啟動(dòng)子活性。推測姜黃素可能通過抑制CCR5 啟動(dòng)子活性下調(diào)細(xì)胞表面CCR5 蛋白表達(dá)來影響HIV-1 侵入人體。為了進(jìn)一步驗(yàn)證姜黃素對CCR5 的作用機(jī)制，將海腎熒光素酶報(bào)告基因Rluc和CCR5啟動(dòng)子基因重組入含有Firely 熒光素酶報(bào)告基因的pGL4.10 表達(dá)載體上，構(gòu)建了重組載體pFireRluc-CCR5，能夠同時(shí)表達(dá)Firely和Rluc，并以Rluc 作為內(nèi)對照，降低了本底的影響，提高了轉(zhuǎn)染效率。將該雙報(bào)告載體轉(zhuǎn)染入293T 細(xì)胞，能夠較真實(shí)反映出CCR5 啟動(dòng)子活性?？占?xì)胞對照組與轉(zhuǎn)染重組載體pFireRluc-CCR5 組的雙熒光酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：pFireRluc-CCR5 重組載體轉(zhuǎn)染成功且所構(gòu)建載體具有活性。通過用不同濃度的姜黃素對轉(zhuǎn)染pFireRluc-CCR5 的細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，雙熒光酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示：隨著姜黃素濃度的增加，CCR5 啟動(dòng)子活性顯著下調(diào)，提示姜黃素對CCR5 啟動(dòng)子具有抑制作用，且具有劑量依賴性。因此推測，姜黃素可能通過抑制CCR5 活性，減少細(xì)胞表面CCR5的表達(dá)從而影響HIV-1侵入人體。

綜上，姜黃素可能通過抑制CCR5 活性從而影響HIV-1 侵入人體，姜黃素影響HIV-1 感染輔助受體CCR5 的直接作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步深入研究，也是本課題組下一步準(zhǔn)備進(jìn)行的研究內(nèi)容，所獲得的研究成果有望提升現(xiàn)有抗艾滋病治療的效果，對減少抗病毒藥物的使用及長期服藥的毒副作用以及降低經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等具有重要意義。同時(shí)，pFireRluc-CCR5 雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體的成功構(gòu)建，也為針對CCR5 靶點(diǎn)活性抑制劑的篩選奠定了基礎(chǔ)。