李婷 王愛平 王紅玲 劉適 郭文濤（三亞市人民醫(yī)院消化內(nèi)科一區(qū)，海南572000）

胃癌是胃黏膜癌變的一種惡性腫瘤。目前胃癌已經(jīng)是全球癌癥相關(guān)死亡率第三的惡性癌癥，2013年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，約有98.4萬胃癌新發(fā)病例和84.1萬死亡病例，且近年來數(shù)字進(jìn)一步增長［1］。由于早期患者缺乏具體的疾病表現(xiàn)，大多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已經(jīng)疾病晚期階段，預(yù)后較差［2］。

溶瘤病毒可以在腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制，并能夠摧毀癌細(xì)胞，進(jìn)一步將腫瘤抗原暴露至抗原提呈細(xì)胞中［3］。一些研究表明，其可以通過局部免疫激活、免疫原性溶瘤細(xì)胞死亡、新抗原釋放和呈遞，以及改變免疫抑制的腫瘤微環(huán)境來激活T細(xì)胞反應(yīng)，從而進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。值得注意的是，近年來，具有腫瘤選擇性的溶瘤病毒被證明可作為一種載體，攜帶一些免疫調(diào)節(jié)因子進(jìn)入腫瘤微環(huán)境，從而改變腫瘤微環(huán)境。用攜帶致炎細(xì)胞因子編碼基因的腫瘤選擇性溶瘤病毒治療有望增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的抗腫瘤免疫反應(yīng)，一些溶瘤病毒已經(jīng)在幾種癌癥中進(jìn)行評估［4-6］。Talimogene laherparepvec（T-VEC）于2015年在美國被批準(zhǔn)為治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的一類溶瘤病毒，是一種工程化的單純皰疹病毒，插入編碼粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）的基因作為免疫佐劑來調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境［7-8］。Pexastimogene devacirepvec（PexA-VEC，JX-594）也攜帶編碼GM-CSF的基因，目前已經(jīng)在晚期肝細(xì)胞癌患者的Ⅲ期臨床試驗(yàn)中進(jìn)行活性評估［9-10］。

有研究表明，溶瘤病毒感染后腫瘤微環(huán)境中PD-L1表達(dá)會(huì)上調(diào)，導(dǎo)致腫瘤對溶瘤免疫治療產(chǎn)生抵抗，這一問題應(yīng)當(dāng)在溶瘤病毒治療過程中予以克服［11］。本研究中，構(gòu)建了一種共表達(dá)PD-L1抑制劑和GM-CSF的工程溶瘤痘苗病毒。發(fā)現(xiàn)這種工程化溶瘤病毒能夠有效裂解腫瘤細(xì)胞并表達(dá)PD-L1抑制劑，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明其可以增強(qiáng)溶瘤病毒的抗腫瘤活性，激活腫瘤特異性T細(xì)胞。結(jié)果表明，這種工程化的溶瘤病毒對胃癌的治療提供了一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞人胃癌細(xì)胞MGC803及人胃癌細(xì)胞AGS由中科院上海細(xì)胞庫提供；鼠胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞及HUTK-143B細(xì)胞由美國模式菌種保藏庫提供。以上所有細(xì)胞均在DMEM完全培養(yǎng)基（額外添加10%FBS）37℃、5%CO2條件下生長。

1.1.2 試劑MTT及二甲基亞砜購自美國Sigma公司，anti-CD8、anti-IFN-γ及anti-TNF-α流式抗體購自Biolegend（美國），anti-PD-L1抗體購自R&D（美國）。GAPDH購自杭州聯(lián)科生物科技有限公司。Fix/Perm溶液及Perm/Wash溶液購自BD Biosciences（美國）。

1.2 方法

1.2.1 重組病毒的構(gòu)建PD-L1抑制劑由PD-1受體胞外結(jié)合域與IgG1 Fc片段組成。穿梭載體pSel-DsRed2N1中插入PSE/l啟動(dòng)子控制的iPDL1或/和p7.5啟動(dòng)子控制下的GM-CSF。為獲得重組溶瘤痘病毒（OV），以VGF基因缺失的vSC20為親本病毒進(jìn)行同源重組。將vSC20以MOI值為0.1感染HUTK-143B細(xì)胞2 h，然后將重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUTK-143B細(xì)胞。挑選3個(gè)RFP陽性斑塊進(jìn)行分離并使其懸浮，進(jìn)一步感染HUTK-143B細(xì)胞，重復(fù)3個(gè)周期的空斑選擇，直到所有斑塊均為RFP陽性。1 000 r/min離心5 min去掉上清液收獲細(xì)胞。再懸浮于冰浴的10 mmol/L Tris緩沖液（pH=9.0）中，超聲1 min，干冰/乙醇交替浴凍融3次。將細(xì)胞裂解液小心預(yù)置于2 ml 40%蔗糖溶液中，在4℃、20 000 r/min離心2 h。將超速離心后試管底部的白色顆粒重懸在200 ml 10 mmol/L Tris緩沖液中，保存于-80℃。病毒滴定通過HuTK-143B細(xì)胞（2×105個(gè)）接種于12孔板中，在細(xì)胞單層上加入10倍梯度稀釋的病毒溶液。搖床上孵育1 h后，加入2 ml培養(yǎng)基，孵育24~48 h，洗滌并固定于0.1%結(jié)晶紫的乙醇溶液中。在顯微鏡下對斑塊進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2 Western blot用MOI值為1的溶瘤病毒感染MFC細(xì)胞，孵育48 h后收集上清液，10 000 r/min離心2 min。細(xì)胞在1×RIPA緩沖液和1×蛋白酶抑制劑中冰浴15 min，10 000 r/min離心2 min。用12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在含有5%脫脂牛奶的TBS緩沖液中室溫下封閉60 min。使用抗PD-1一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，用TBST清洗后與羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h后，用奧德賽成像儀進(jìn)行曝光。GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.3 MTT檢測細(xì)胞毒作用將腫瘤細(xì)胞以1×104個(gè)/孔 接種 于96孔 板中，并 以不 同MOI值（0.1、0.5、1、5）的溶瘤病毒對細(xì)胞進(jìn)行感染。腫瘤細(xì)胞活力測定采用MTT法。在VersaMax酶標(biāo)儀上以490 nm波長讀取光密度。細(xì)胞裂解率（%）=［1-OD570（實(shí)驗(yàn)組）/OD570（對照組）］×100%

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞經(jīng)過溶瘤病毒感染后，離心收集細(xì)胞，洗滌3次后用抗PD-L1的抗體避光孵育30 min，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

腫瘤組織經(jīng)過消化及過濾獲得單細(xì)胞懸液，細(xì)胞表面染色通過anti-CD8抗體避光孵育30 min，之后利用PBS洗滌3次，然后進(jìn)行胞內(nèi)抗原染色，用于檢測IFN-γ和TNF-α的表達(dá)量。細(xì)胞在Fix/Perm溶液中固定后，用Perm/Wash Buffer洗滌，然后使用抗體細(xì)胞內(nèi)染色30 min，Perm/Wash Buffer洗滌后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。所有樣本在LSRⅡ細(xì)胞儀（BD）上進(jìn)行操作，并用FACS DIVA軟件v8.0（BD Biosciences）進(jìn)行分析。

1.2.5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將5~7周齡的雌性裸鼠飼養(yǎng)在武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在標(biāo)準(zhǔn)無菌室中飼養(yǎng)，每日監(jiān)測。在小鼠皮下注射MFC細(xì)胞建立異種移植模型。接種后第7天，通過瘤周注射PBS，OV-GM，OV-GM/iPD-L1（5×107PFU/只）監(jiān)測腫瘤的生長狀況。每2~3 d檢查1次瘤體積和小鼠體重。對表現(xiàn)出垂死狀態(tài)的小鼠實(shí)施安樂死。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對腫瘤進(jìn)行剝離，拍照稱重。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示，組間樣本比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 工程化溶瘤病毒的構(gòu)建及驗(yàn)證本研究中構(gòu)建了3種溶瘤病毒，分別為OV，編碼GM-CSF的溶瘤痘病毒（OV-GM）以及同時(shí)編碼GM-CSF和PD-L1抑制劑的溶瘤痘病毒（OV-GM/iPD-L1），如圖1A所示。將3種溶瘤病毒分別感染鼠胃癌細(xì)胞MFC，檢測其分泌PD-L1抑制劑的能力。Western blot結(jié)果表明，只有感染OV-GM/iPD-L1可以分泌PD-L1抑制劑，感染其他病毒的細(xì)胞不能分泌PD-L1抑制劑（圖1B、C）。以上結(jié)果說明所構(gòu)建的溶瘤病毒可以有效感染腫瘤細(xì)胞并表達(dá)相應(yīng)的目的蛋白。

圖1 重組溶瘤病毒的產(chǎn)生和鑒定Fig.1 Generation and characterization of recombinant oncolytic virus

2.2 溶瘤病毒對靶細(xì)胞的裂解能力如圖2所示，分別選取了小鼠胃癌細(xì)胞MFC、人胃癌細(xì)胞MGC803及人胃癌細(xì)胞ASG作為靶細(xì)胞，將不同的溶瘤病毒以不同的MOI值分別感染腫瘤細(xì)胞，檢測其對靶細(xì)胞的裂解能力。結(jié)果表明，3種溶瘤病毒都可以有效的感染并裂解腫瘤細(xì)胞，并且3種溶瘤病毒的溶瘤能力隨著MOI值的升高而增強(qiáng)。以上結(jié)果表明，這3種OV病毒可以以劑量依賴的方式裂解腫瘤細(xì)胞。

圖2 重組溶瘤病毒在不同MOI下對靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性Fig.2 Cytotoxicity of recombinant oncolytic virus to tar?get cells in different MOI

2.3 OV-GM/iPD-L1中和靶細(xì)胞PD-L1的表達(dá)用OV-GM和OV-GM/iPD-L1溶瘤病毒分別感染MFC細(xì)胞后，檢測其對腫瘤細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)的影響（圖3）。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，與OV-GM感染相比，感染OV-GM/iPD-L1的腫瘤細(xì)胞表面PDL1的表達(dá)量明顯降低，（t=22.98，P<0.000 1，圖3）。以上結(jié)果表明，OV-GM/iPD-L1分泌的PD-L1抑制劑可以中和腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)。

圖3 感染細(xì)胞中PD-L1表達(dá)的分析Fig.3 Analysis of PD-L1 expression in infected cells

2.4 OV-GM/iPD-L1的體內(nèi)抗腫瘤活性首先建立了小鼠胃癌細(xì)胞的皮下移植瘤模型，瘤周注射PBS、OV-GM及OV-GM/iPD-L1，監(jiān)測腫瘤的生長情況，結(jié)果表明，OV-GM和OV-GM/iPD-L1治療較對照組而言可以顯著抑制腫瘤的生長，而OV-GM/iPD-L1的抑制腫瘤生長的能力較OV-GM更強(qiáng)（t=13.32，P<0.05，圖4A）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分析腫瘤重量，結(jié)果表明OV-GM/iPD-L1治療組的腫瘤質(zhì)量比OV-GM治療組更輕（t=3.641，P<0.05，圖4B、C）。并且在整個(gè)治療過程中，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的小鼠體重?zé)o顯著性差異，說明并沒有產(chǎn)生明顯的毒性（圖4D）。以上結(jié)果說明，OV-GM/iPD-L1可以顯著抑制小鼠體內(nèi)的腫瘤生長。

圖4 重組溶瘤病毒對小鼠胃移植瘤的抗腫瘤效果Fig.4 Antitumor efficacy of recombinant oncolytic virus against xenografts derived from gastric tumor cell lines in mice

2.5 OV-GM/iPD-L1對浸潤T細(xì)胞的抗腫瘤活性的影響對各個(gè)治療組小鼠的腫瘤浸潤T細(xì)胞的抗腫瘤活性進(jìn)行了分析（圖5）。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，OV-GM/iPD-L1治療組的腫瘤浸潤T細(xì)胞中，IFN-γ+（t=9.214，P<0.01，圖5A、B）及TNF-α+（t=3.207，P<0.05，圖5A、C）的T細(xì)胞比OV-GM治療后的腫瘤浸潤T細(xì)胞明顯增多，說明OV-GM/iPD-L1顯著增強(qiáng)了小鼠自身T細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)?？傊陨蠈?shí)驗(yàn)說明OV-GM/iPD-L1可以通過抑制PD-1/PD-L1通路增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤免疫功能，從而協(xié)同增強(qiáng)抑制腫瘤的能力。

圖5 腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞免疫活性的流式細(xì)胞術(shù)分析Fig.5 Flow analysis of immune activity of tumor infiltrat?ing lymphocytes

3 討論

胃癌是全球發(fā)病率第四的癌癥，同時(shí)也是全球第三大病死率的癌癥。目前來看，早期的胃癌患者和可以通過化療及靶向治療藥物獲得較好的治療效果，但是一些晚期以及一些復(fù)發(fā)的患者沒有很好的治療手段，因此急需開發(fā)有效的藥物來應(yīng)對這一挑戰(zhàn)［12］。

溶瘤病毒具有選擇性感染腫瘤細(xì)胞的能力，而對正常細(xì)胞的感染能力有限。由于溶瘤病毒在腫瘤治療領(lǐng)域的潛力，現(xiàn)在已經(jīng)有越來越多的臨床前研究探索其在實(shí)體瘤中的應(yīng)用［13-14］。本研究結(jié)果表明，共表達(dá)OV-GM/iPDL1能夠產(chǎn)生PD-L1抑制劑，并能夠中和腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)。瘤內(nèi)注射OVGM/iPDL1可有效抑制腫瘤生長，并增強(qiáng)自身的T細(xì)胞的抗腫瘤活性，從而更有效地阻斷腫瘤生長。

在一些早期研究中，溶瘤病毒被工程化改造，使其可以表達(dá)免疫刺激因子，如熱休克蛋白、趨化因子和細(xì)胞因子，以激活抗腫瘤免疫反應(yīng)［15-16］。然而，到目前為止，溶瘤病毒療法對癌癥患者的療效有限。最近的一些研究報(bào)道了表達(dá)PD-1/PD-L1抑制劑的武裝溶瘤病毒，可以激活抗腫瘤免疫反應(yīng)［17］。一種表達(dá)抗人PD-L1抗體的“武裝”溶瘤腺病毒被證明能增強(qiáng)人腫瘤異種移植模型中的溶瘤活性［18］。表達(dá)PD-1單鏈抗體的溶瘤單純皰疹病毒（HSV）在臨床前的腦膠質(zhì)瘤小鼠模型中被發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)持續(xù)的抗腫瘤反應(yīng)［19］。一種表達(dá)PD-1胞外區(qū)的重組黏液瘤病毒（VPD1）被發(fā)現(xiàn)能抑制PD-1/PDL1信號(hào)通路，并激活抗腫瘤免疫［20］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染后腫瘤微環(huán)境中PD-L1表達(dá)的反應(yīng)性上調(diào)導(dǎo)致腫瘤對溶瘤免疫治療產(chǎn)生抵抗［21］。本研究證明，“武裝”溶瘤病毒分泌的PD-L1抑制劑、GMCSF產(chǎn)生了較傳統(tǒng)的溶瘤病毒更好的抑瘤活性，這一方面歸因于PD-L1抑制劑與腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)的PD-L1結(jié)合，解除了免疫抑制活性，同時(shí)GM-CSF作為一種免疫刺激因子，進(jìn)一步激活了機(jī)體的免疫反應(yīng)，在本項(xiàng)研究中，這種協(xié)同增效的作用充分反應(yīng)在經(jīng)過“武裝”溶瘤病毒治療后，腫瘤浸潤的CD8+T細(xì)胞的炎癥細(xì)胞因子分泌能力顯著增強(qiáng)，因此這種經(jīng)過改造的溶瘤病毒代表了一種有效的、個(gè)體化的腫瘤特異性溶瘤免疫療法。

綜上所述，這種經(jīng)過改造的溶瘤病毒能夠通過發(fā)揮溶瘤活性，并通過表達(dá)GM-CSF和PD-L1抑制劑產(chǎn)生協(xié)同作用來激活T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)，從而提供了一種有效的、特異性的腫瘤免疫療法，該療法可單獨(dú)或與免疫檢查點(diǎn)抑制劑、靶向治療和化療聯(lián)合用于胃癌患者，為胃癌的治療提供新的思路。