李香蘭，黃哲浩，姜日花*，池光范

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 a.皮膚科；b.神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

P物質(zhì)(SP)是含有11個(gè)氨基酸的神經(jīng)肽。研究表明，感覺(jué)神經(jīng)通過(guò)釋放SP等神經(jīng)肽[1]，參與皮膚炎癥和創(chuàng)傷后修復(fù)[2]。軟組織損傷刺激這些傳入神經(jīng)末梢釋放SP，影響神經(jīng)源性炎癥和成纖維細(xì)胞增殖[3]。Nilsson等的研究發(fā)現(xiàn)增生性瘢痕中SP陽(yáng)性神經(jīng)纖維增多，提示SP可能參與了病理性瘢痕的形成[4]。本研究基于觀察瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞源性SP對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞外基質(zhì)沉積的作用及對(duì)成纖維細(xì)胞遷移的影響，探討其機(jī)制及相關(guān)治療方案。

1 材料與方法

1.1 收集瘢痕疙瘩組織及正常皮膚組織

收集了2017年至2019年就診于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院患者的瘢痕疙瘩組織樣本20例，包括前胸、后背的瘢痕疙瘩10例，耳部瘢痕疙瘩10例。同時(shí)收集了前胸及后背正常皮膚組織樣本10例，組織樣本均來(lái)自本院皮膚科。所獲取的組織經(jīng)福爾馬林固定制作蠟塊組織標(biāo)本及組織切片，進(jìn)行HE染色及組織免疫化學(xué)染色。收集了3例新鮮瘢痕疙瘩組織及3例正常新鮮皮膚組織，用于分離培養(yǎng)瘢痕疙瘩及正常皮膚成纖維細(xì)胞。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

SP免疫組織化學(xué)試劑盒(中國(guó)福州邁新生物技術(shù)有限公司)，DAB顯色液(中國(guó)福州邁新生物技術(shù)有限公司)，DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(以色列 BI 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1HE染色及免疫組織化學(xué)染色 所獲取的組織經(jīng)福爾馬林固定制作蠟塊組織標(biāo)本及組織切片，進(jìn)行組織免疫化學(xué)染色。

1.3.2皮膚成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng) 手術(shù)中切下的瘢痕疙瘩或正常皮膚組織移至無(wú)菌培養(yǎng)皿中；加入0.2%中性蛋白酶溶液，4℃，4-8小時(shí)；表皮層和真皮層分離，將真皮層反復(fù)剪切至泥狀，加入Ⅰ型膠原酶溶液，37℃搖床，3-5小時(shí)；加入等量培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹吸，80目濾網(wǎng)過(guò)濾；離心，保留沉淀，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；接種細(xì)胞至培養(yǎng)瓶中，置入37℃含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3細(xì)胞免疫熒光染色 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞；使用6孔板鋪板；24小時(shí)后使用 4%多聚甲醛固定細(xì)胞；0.1%Triton-X100孵育20 min；BSA封閉30 min；SP抗體封閉過(guò)夜(1∶50，Santa Cruz)；去除一抗，加入熒光二抗(1∶200,abcam)，避光，孵育2 h；用含DAPI的封閉液封片；在倒置顯微鏡下，觀察照相。

1.3.4TAC1 siRNA轉(zhuǎn)染 使用lipofectamine2000(lipo2000，Invitrogen)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。TAC1 siRNA 由廣州銳博生物提供，siG000006863B，序列為AAGACGTTAATAAACTACC，轉(zhuǎn)染濃度為50 nM。

1.3.5Western Blot 提取蛋白、測(cè)蛋白濃度；配膠，煮蛋白上樣；進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳濃縮、分離和轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉；一抗孵育：Substance P(1∶500，Novus)，Collagen I(1∶5 000，Abcam)，Collagen III(1∶5 000，Abcam)，4℃過(guò)夜；二抗(山羊抗兔Ig G-HRP 抗體,1∶5 000，中國(guó)北京中杉金橋生物有限公司)孵育；ECL顯色液反應(yīng)顯色，在凝膠圖像分析儀拍照。

1.3.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞進(jìn)行TAC1 siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，用20 μl無(wú)菌槍頭沿培養(yǎng)板底部劃一 直線(xiàn)，PBS緩沖液沖洗以去除漂浮細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，倒置顯微鏡觀察劃痕區(qū)相對(duì)距離。

1.3.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 GraphPad prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異比較采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用平均值±SD 表示。

2 結(jié)果

2.1 瘢痕疙瘩組織的病理學(xué)特點(diǎn)

瘢痕疙瘩組織具有過(guò)度生長(zhǎng)、病變的發(fā)展超出原損傷界限、呈瘤樣增生等特征。HE染色提示瘢痕疙瘩組織中成纖維細(xì)胞過(guò)度增生，細(xì)胞外基質(zhì)成分增加，膠原蛋白過(guò)度沉積(圖1)。

圖1 H&E染色 瘢痕疙瘩組織中成纖維細(xì)胞過(guò)度增生，細(xì)胞外基質(zhì)成分增加，膠原蛋白過(guò)度沉積

2.2 瘢痕疙瘩組織中SP表達(dá)增加

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與正常皮膚組織相比瘢痕疙瘩組織SP抗原抗體反應(yīng)顯著陽(yáng)性，主要表達(dá)在真皮層瘢痕疙瘩細(xì)胞外基質(zhì)和纖維細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。定量分析結(jié)果顯示與正常皮膚組織相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

A:瘢痕疙瘩組織高表達(dá)SP。B:與正常皮膚組織相比均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。

2.3 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的形態(tài)觀察

在倒置相差顯微鏡下，培養(yǎng)得到的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞表現(xiàn)為形態(tài)肥大，體積明顯大于正常的成纖維細(xì)胞(圖3)。

圖3 倒置相差顯微鏡顯示的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞形態(tài)，該細(xì)胞形態(tài)肥大，體積明顯大于正常的成纖維細(xì)胞

2.4 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中SP高表達(dá)

細(xì)胞免疫熒光染色顯示，與正常皮膚組織相比瘢痕疙瘩組織SP抗原抗體反應(yīng)顯著陽(yáng)性，主要表達(dá)在成纖維細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。定量分析結(jié)果顯示與正常皮膚組織相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)圖4)。

A:瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞高表達(dá)SP。B:與正常皮膚成纖維細(xì)胞相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。

2.5 敲減TAC1基因后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞SP、Ⅰ型膠原蛋白及Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)減少

TAC-1基因轉(zhuǎn)錄翻譯為SP蛋白。應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)敲減TAC-1基因表達(dá)后，與正常成纖維細(xì)胞相比瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞顯著減少SP、Ⅰ型膠原蛋白(Collagen I)及Ⅲ型膠原蛋白(Collagen Ⅲ)的表達(dá)，均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)圖5)。

敲減TAC-1基因后，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞減少表達(dá)SP、Ⅰ型膠原蛋白及Ⅲ型膠原蛋(P<0.01)。

2.6 敲減TAC1明顯抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的移行能力

未敲減 TAC1的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(對(duì)照組)與敲減 TAC1的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)相比，在劃痕形成24小時(shí)后，已有大量成纖維細(xì)胞向劃痕處移行，劃痕界面已基本愈合，但是實(shí)驗(yàn)組仍然觀察到了無(wú)細(xì)胞的明顯的劃痕界面，劃痕面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖6)。

敲減 TAC1的實(shí)驗(yàn)組劃痕愈合能力明顯低于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01

3 討論

瘢痕疙瘩是一種與遺傳及免疫功能等因素有關(guān)的皮膚成纖維細(xì)胞異常增生性疾病[5]。此次實(shí)驗(yàn)中，瘢痕疙瘩組織HE染色表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞過(guò)度增生，細(xì)胞外基質(zhì)成分增加，膠原蛋白過(guò)度沉積，呈瘤樣增生等特點(diǎn)，與以往的其他研究結(jié)果相一致。

SP在人類(lèi)和嚙齒動(dòng)物中廣泛表達(dá)，并在各種生物過(guò)程中發(fā)揮多種作用。Euler和Gaddum[6]首次報(bào)道了SP對(duì)胃腸道平滑肌的舒張和收縮作用。隨后的研究表明，SP是一種與疼痛傳遞相關(guān)的神經(jīng)元感覺(jué)介質(zhì)，因?yàn)樗诩顾璞掣叨燃校琒P還與神經(jīng)元組織[7]、炎癥[8]和痛覺(jué)的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)[9]。本研究免疫組織化學(xué)染色中，瘢痕疙瘩組織細(xì)胞外基質(zhì)和成纖維細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)均高表達(dá)SP，提示SP不僅來(lái)源于真皮中的神經(jīng)，與患者的瘙癢和疼痛等臨床癥狀正相關(guān)，還有瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞自身也合成分泌SP，通過(guò)自分泌和旁分泌作用調(diào)控瘢痕疙瘩中成纖維細(xì)胞的細(xì)胞特性，促進(jìn)瘢痕疙瘩病理發(fā)展。SP在皮膚組織損傷后的病理生理作用，包括修復(fù)和異常增殖中的作用已被報(bào)道[10]。陳靜等在研究中發(fā)現(xiàn)在 SP 通過(guò)調(diào)控成纖維細(xì)胞凋亡相關(guān)基因-PCNA、bcl-2的表達(dá)而參與病理性瘢痕形成,該作用由 SP受體介導(dǎo)[11]。但這些研究主要集中在外來(lái)SP對(duì)成纖維細(xì)胞的影響。本研究發(fā)現(xiàn)敲減瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的TAC-1基因后，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞減少SP、Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)，推測(cè)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞分泌的SP通過(guò)調(diào)控Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，進(jìn)一步促進(jìn)瘢痕疙瘩的病理發(fā)展。

瘢痕疙瘩有向周邊侵襲生長(zhǎng)的特性，這與成纖維細(xì)胞遷移能力有關(guān)。劃痕實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，敲減 TAC1的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞劃痕界面中遷移能力顯著降低，提示瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞分泌的SP對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的移行能力有顯著性促進(jìn)作用。國(guó)內(nèi)其他學(xué)者認(rèn)為[12]SP對(duì)成纖維細(xì)胞的促增殖作用可被它的神經(jīng)激膚1(NK1)受體拮抗劑 spanitde 抑制或部分抑制,提示SP誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖作用與NK1功能有關(guān)。說(shuō)明應(yīng)用NK1受體抑制劑，阻斷SP的作用不僅達(dá)到抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞遷移，還能抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和Ⅰ型及Ⅲ膠原細(xì)胞外基質(zhì)的合成分泌，抑制瘢痕疙瘩生長(zhǎng)和過(guò)度擴(kuò)張，從而達(dá)到緩解治療瘢痕疙瘩的目的。

此次研究發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞合成分泌SP并進(jìn)一步揭示了瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞來(lái)源SP在瘢痕疙瘩組織中的作用機(jī)制，為瘢痕疙瘩新藥物的開(kāi)發(fā)研究提供了新的方向。