王 敏，曾祚萍，李佳慧，崔君澤，楊淑莉

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，吉林 長(zhǎng)春130041)

卵巢癌可發(fā)生在任何年齡段，50歲以上女性為主要發(fā)病群體，通常發(fā)現(xiàn)即為晚期，預(yù)后較差[1]。卵巢癌患者在持續(xù)化療過(guò)程中機(jī)體會(huì)出現(xiàn)耐藥，并且耐藥程度會(huì)逐漸增加[2]。TRAIL作為TNF相關(guān)凋亡的誘導(dǎo)配體，其自身不具明顯毒性，TRAIL能上調(diào)DR4、DR5的表達(dá)從而發(fā)揮殺滅腫瘤細(xì)胞的作用[3]。姜黃植物根莖的姜黃素經(jīng)相關(guān)研究顯示其抗氧化、抗癌及抗炎癥方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，如配合其他藥物聯(lián)用可能發(fā)揮抗癌功效，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[4-5]。本文探討姜黃素聯(lián)合TRAIL誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞的凋亡及其相關(guān)機(jī)制，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料SKOV-3和OVCAR-3細(xì)胞株由吉林大學(xué)第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供，重組人TRAIL蛋白購(gòu)自美國(guó)RD公司，MTT、DMSO自美國(guó)Sigma公司購(gòu)入，美國(guó)Hyclone公司的RPMI1640培養(yǎng)基，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒美國(guó)BD公司購(gòu)置，Caspase活性檢測(cè)試劑盒由江蘇碧云天生物技術(shù)研究所支持，酶標(biāo)儀為美國(guó)雷勃公司Thermo Multiskan MK3，流式細(xì)胞儀采用美國(guó)BD公司Accuri。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存 將凍存管從-150℃超低溫冰箱中取出置于37℃水浴箱中，自主晃動(dòng)使其融化，將細(xì)胞懸液放入離心管。將SKOV-3和OVCAR-3細(xì)胞株分別置于5 ml含10%新生牛血清RPMI1640培養(yǎng)基，打碎均勻后經(jīng)800 rpm離心，棄上清，于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種后置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，至80%-90%細(xì)胞貼壁覆蓋進(jìn)行傳代，將舊培養(yǎng)液棄除，并用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞，在1 ml 0.25%胰酶條件下鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)圓潤(rùn)、回縮時(shí)加入10%新生牛血清2 ml培養(yǎng)基。將貼壁細(xì)胞予以離心處理，按1∶2比例將沉淀白色細(xì)胞接種至新培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2條件繼續(xù)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以DMSO/新生牛血清1∶9混合為細(xì)胞凍存液，予以離心處理后凍存重懸細(xì)胞，濃度調(diào)整為1×107/ml，以1 ml進(jìn)行分裝，最終凍存于-150℃超低溫冰箱。

1.2.2分組及給藥 設(shè)置空白對(duì)照組(僅SKOV-3和OVCAR-3培養(yǎng)基)、姜黃素組(予以姜黃素濃度為10 μmol/L及50 μmol/L的SKOV-3和OVCAR-3培養(yǎng)基)、TRAIL組(予以重組人TRAIL蛋白濃度為25 ng/ml及75 ng/ml的SKOV-3和OVCAR-3培養(yǎng)基)及姜黃素聯(lián)合TRAIL組(不同濃度姜黃素與不同濃度的重組人TRAIL蛋白兩兩配比的SKOV-3和OVCAR-3培養(yǎng)基)。每組3復(fù)孔，至70%-80%細(xì)胞貼壁融合，作24 h同步化處理后施加相應(yīng)濃度藥物，置于37℃、5%CO2條件繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 觀察指標(biāo)觀察四組細(xì)胞活力，細(xì)胞凋亡，caspase-3、caspase-8及caspase-9活化的表達(dá)水平。其中，①細(xì)胞活力：由MTT法檢測(cè)，細(xì)胞活力百分比=(試驗(yàn)吸光度)/(空白對(duì)照吸光度)×100%；②細(xì)胞凋亡：采用流式細(xì)胞術(shù);③caspase-3、caspase-8及caspase-9的表達(dá)水平：用Western blot檢測(cè)caspase-3、caspase-8及caspase-9活化，由Caspase活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS22.0軟件作處理分析，以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，細(xì)胞活力，細(xì)胞凋亡，caspase-3、caspase-8及caspase-9活化的表達(dá)水平采用t檢驗(yàn)，若P<0.05，差異認(rèn)定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活力及增殖抑制效果姜黃素組細(xì)胞活力比較，不同濃度下，姜黃素作用于SKOV-3及OVCAR-3細(xì)胞的時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞活力越低，且兩組細(xì)胞在姜黃素濃度為50 μmol/L、吸光度時(shí)間為48 h時(shí)細(xì)胞活力達(dá)到最低，均低于空白對(duì)照組(P<0.05)；TRAIL組細(xì)胞活力比較，不同濃度下，重組人TRAIL蛋白作用于SKOV-3及OVCAR-3細(xì)胞吸光度的時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞活力越低，且兩組細(xì)胞均于75 ng/ml、吸光度48 h時(shí)細(xì)胞活力達(dá)到最低，與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；姜黃素組+TRAIL組兩兩配比不同濃度下，濃度為(10 μmol/L+25 ng/ml)條件下，SKOV-3及OVCAR-3細(xì)胞活力隨作用時(shí)間增加而下降，在(50 μmol/L+75 ng/ml)條件下，SKOV-3及OVCAR-3細(xì)胞活力在吸光度48 h時(shí)達(dá)到最低，與空白對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1、2、3。

表1 姜黃素組細(xì)胞活力

表2 TRAIL組細(xì)胞活力

表3 姜黃素組聯(lián)合TRAIL組細(xì)胞活力

2.2 細(xì)胞凋亡統(tǒng)計(jì)SKOV-3及OVCAR-3細(xì)胞中各組細(xì)胞凋亡率，姜黃素組、TRAIL組及姜黃素組+TRAIL組的細(xì)胞凋亡率均高于空白對(duì)照組(P<0.05)，且姜黃素組+TRAIL組，不同配比濃度下的凋亡率均大于相應(yīng)劑量姜黃素組及TRAIL組凋亡率(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 細(xì)胞凋亡

2.3 caspase-3、caspase-8及caspase-9活化姜黃素組、TRAIL組及姜黃素組+TRAIL組caspase-3、caspase-8及caspase-9活化水平與空白對(duì)照組比較，均高于空白對(duì)照組(P<0.05)，且其中caspase-3活化水平存在顯著提升(P<0.05)，見(jiàn)表5、6、7。

表5 姜黃素組caspase-3、caspase-8及caspase-9活化

表6 TRAIL組caspase-3、caspase-8及caspase-9活化

表7 姜黃素組+TRAIL組caspase-3、caspase-8及caspase-9活化

3 討論

據(jù)2015年中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)報(bào)告指出：中國(guó)卵巢惡性腫瘤發(fā)病率為 52.1/10萬(wàn)，死亡率為22.5/10萬(wàn)，對(duì)女性生命健康造成極大威脅[6-7]。卵巢惡性腫瘤無(wú)典型早期癥狀，故篩查、診斷難度較高，多數(shù)患者首次就診已為中晚期[8]。目前以根治術(shù)輔助化療為主要治療手段，可有效抑制腫瘤細(xì)胞活性，但持續(xù)治療過(guò)程中，機(jī)體耐藥性上升。TRAIL是TNF超家族成員之一，能特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且對(duì)正常細(xì)胞不具毒性，是臨床公認(rèn)的一種抗腫瘤藥物[9-11]。姜黃素為一類植物多酚類化合物，毒性及副作用較小，加上對(duì)腫瘤細(xì)胞活性有抑制作用，還可與其他化療藥物聯(lián)合使用提高療效[12]。本文通過(guò)探究姜黃素聯(lián)合TRAIL誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞的凋亡及其相關(guān)機(jī)制，為卵巢癌的治療提供新思路。

據(jù)Iqbal B等學(xué)者[13]研究指出：KCL-22髓樣細(xì)胞施以不同濃度的姜黃素及TRAIL的抗腫瘤效果與單一用藥相比，細(xì)胞活力明顯降低，且該研究認(rèn)為caspase-3活性增強(qiáng)、NF-κB活性抑制與KCL-22細(xì)胞凋亡有一定的關(guān)聯(lián)。本研究則分析了姜黃素、TRAIL在不同濃度下，細(xì)胞活力和凋亡情況與作用時(shí)間的關(guān)系，結(jié)果顯示：姜黃素組+TRAIL組兩兩配比濃度下作用于SKOV-3及OVCAR-3細(xì)胞，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，于48 h時(shí)，兩組細(xì)胞活力均在配比濃度(50 μmol/L+75 ng/ml)時(shí)細(xì)胞活力達(dá)到最低，且通過(guò)抑制率公式計(jì)算分析，該時(shí)點(diǎn)的抑制率最高。據(jù)此可知姜黃素聯(lián)合TRAIL可發(fā)揮細(xì)胞增殖抑制效果，在高濃度長(zhǎng)時(shí)點(diǎn)下細(xì)胞增殖抑制效果明顯提升。而姜黃素組+TRAIL組配比濃度為(50 μmol/L+75 ng/ml)時(shí)的腫瘤細(xì)胞凋亡效果最佳，與同一濃度下單一藥物凋亡率比較，聯(lián)合用藥凋亡率明顯更高，推測(cè)上述兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用可發(fā)揮協(xié)同效果，誘導(dǎo)凋亡效果更佳。究其原因，可能與Obaidi I等學(xué)者[14]及Kong WY等學(xué)者[15]相關(guān)研究中TRAIL所起增敏效果與人乳腺腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡有密切聯(lián)系。另從caspase-3、caspase-8及caspase-9活化結(jié)果表明：姜黃素組+TRAIL組中caspase-3活性變化幅度相較于caspase-8及caspase-9活化更高，具有明顯差異，分析原因可能caspase-3屬與誘導(dǎo)凋亡必要通路有關(guān)。這與據(jù)Kamat AM等學(xué)者[16]研究報(bào)道所稱姜黃素可通過(guò)抑制NF-κB和誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞中的TRAIL受體來(lái)增強(qiáng)BCG的抗腫瘤作用結(jié)果相似。現(xiàn)從分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)等角度上分析姜黃素的抗腫瘤細(xì)胞作用機(jī)制，可能因素如下[17]：①在分子水平上，腫瘤細(xì)胞攝取姜黃素，藥物作用靶點(diǎn)增加，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中某些酶、蛋白質(zhì)和基因的表達(dá)；②在細(xì)胞水平上，姜黃素抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，腫瘤細(xì)胞多藥耐藥情況得以逆轉(zhuǎn)，進(jìn)而增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性；③在組織水平上，可抑制腫瘤血管生成。同時(shí)，姜黃素對(duì)人體的毒性和副作用較小，比一般化療藥物更能特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞，且可聯(lián)合其他藥物增加放化療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。這與Kamalabadi-Farahani M等學(xué)者[18]研究報(bào)道DR-5基因在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞中均上調(diào)，但與轉(zhuǎn)移性細(xì)胞相比，原發(fā)性腫瘤細(xì)胞中上調(diào)幅度更高，呈一定相關(guān)性。

綜上所述：姜黃素聯(lián)合TRAIL對(duì)于卵巢癌具有細(xì)胞增殖抑制效果，可通過(guò)增強(qiáng)caspase-3活性有效誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，以50 μmol/L姜黃素+75 ng/ml重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)效果最佳，在考慮毒性情況下合理配比，可提升卵巢癌臨床治療效果，在后續(xù)卵巢癌研究中具有一定參考價(jià)值。