春 蓮,吳偉樂(lè)斯,其勒木格,布仁巴圖

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院 蒙婦科一,內(nèi)蒙 通遼028000；2.內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學(xué)院 內(nèi)蒙 包頭014000；3.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院,內(nèi)蒙 通遼028000；4.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院,內(nèi)蒙 通遼028000)

卵巢儲(chǔ)備功能下降(DOR)進(jìn)一步可發(fā)展為卵巢早衰(POF)[1-5]，目前尚無(wú)有效可行的方法能促進(jìn)受損卵巢功能的恢復(fù)。蘇格木勒-7(蘇-7)成分能夠調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌和性激素功能，故本試驗(yàn)探討蘇格木勒-7對(duì)環(huán)磷酰胺(CTX)致卵巢功能低下大鼠卵巢功能保護(hù)作用的研究，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組10周健康 SD 雌性大鼠 100 只和10周健康 SD 雄性大鼠 12只，體重 170-200 g 左右，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)鼠齡12周3天。購(gòu)買的動(dòng)物先適應(yīng)性喂養(yǎng) 7 天后禁食、不禁水 10 h，第 8 天晨測(cè)體重并開(kāi)始取陰道細(xì)胞檢測(cè)性周期，共 10 天，剔除無(wú)規(guī)律性周期和無(wú)發(fā)情的鼠 4 只，剩余 96 只正常性周期的大鼠按體重排序按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)區(qū)組法分 6 組(n=16)，分別為模型組(CTX)、模型加戊酸雌二醇組(補(bǔ)佳樂(lè)組)、模型加蘇格木勒-7 低劑量組(CTX+蘇-7-0.5 g)、模型加蘇格木勒-7 中劑量組(CTX+蘇-7-1.0 g)、模型加蘇格木勒-7 高劑量組(CTX+蘇-7-2.0 g)和正常組。

1.2 動(dòng)物模型的建立及蘇格木勒-7干預(yù)方案

1.2.1建立動(dòng)物模型 本課題采用 CTX 構(gòu)建卵巢功能損傷模型已經(jīng)相當(dāng)成熟，CTX30 mg/kg·d 連續(xù)給藥 7 天的模型最理想，此方案的大鼠原始卵泡數(shù)顯著減少，AMH 表達(dá)下降，卵巢內(nèi)分泌和生殖功能顯著下降，認(rèn)為此模型最理想。除了正常組外其他5組均連續(xù)7天腹腔注射 CTX 30 mg/kg·d。每天早上 8 點(diǎn)對(duì)大鼠進(jìn)行陰道細(xì)胞涂片分析，一直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，發(fā)情周期出現(xiàn)紊亂或無(wú)發(fā)情周期代表模型成功。

1.2.2藥物制備與給藥方法 蘇-7 由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供(符合 GPP 標(biāo)準(zhǔn)制劑室)。正常組和模型組等量生理鹽水灌胃，其余給藥組在造模第一天開(kāi)始(建模同時(shí))分別灌胃給予蘇-7 高劑量(2.0 g/kg·d)、中劑量(1.0 g/kg·d)、低劑量(0.5 g/kg·d)和戊酸雌二醇(0.1 mg/kg·d)，每天給藥一次，連續(xù)給藥 24 天。所有大鼠均每天監(jiān)測(cè)發(fā)情周期、每周兩次檢測(cè)體重、根據(jù)體重重新計(jì)算給藥劑量、每天檢測(cè)飲食計(jì)量、觀察鼠狀態(tài)、毛色、活動(dòng)等情況。

1.3 生育能力檢測(cè)造模7天+給藥24天后，從 6 組中隨機(jī)選取 24 只大鼠(每組 4 只)，于動(dòng)情期以 2∶1 比例分別與健康且年齡匹配的雄性大鼠進(jìn)行交配，記錄懷孕鼠和新生鼠的數(shù)量、存活情況。

1.4 血清及各臟器標(biāo)本采集造模 7 天+給藥 24 天后，剩余大鼠于動(dòng)情間期進(jìn)行麻醉后打開(kāi)腹腔，腹主動(dòng)脈取血，分離血清并送檢驗(yàn)室以備 ELISA 法檢測(cè)血清激素水平變化。采完血后迅速分離左側(cè)卵巢，分為兩部分，分裝在兩個(gè)速凍管內(nèi)迅速置于液氮中，-80℃保存；分離右側(cè)卵巢、稱重后用 10%中性福爾馬林固定后送至病理科進(jìn)行卵巢連續(xù)切片，HE 染色光鏡下觀察卵巢組織形態(tài)學(xué)變化及記錄不同階段卵泡的數(shù)量；隨后依次完整取出并分離其他臟器(子宮、肝臟、腎臟、脾臟)，光鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)是否正常并稱重。

1.5 觀察指標(biāo)每天取陰道脫落細(xì)胞觀察動(dòng)情周期，大鼠體重及各臟器重量；ELISA 法檢測(cè)血清 E2、FSH、AMH；HE 染色光鏡下觀察卵巢組織形態(tài)學(xué)變化及記錄不同階段卵泡數(shù)量；記錄懷孕鼠和新生鼠的數(shù)量及存活情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS25.0 軟件用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。各組數(shù)據(jù)先用 Levene 法行方差齊性檢驗(yàn)，如果方差齊，則采用單因素方差分析；如果方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蘇格木勒-7 對(duì)化療性卵巢功能低下大鼠一般情況的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)大鼠死亡 14只，其余鼠均存活。正常組大鼠毛色滑順、精力旺盛；模型組大鼠皮毛不柔順、精神萎靡；實(shí)驗(yàn)組大鼠皮毛較為光滑柔順、精神較佳，其中蘇-7中劑量組狀態(tài)最佳。

2.2 實(shí)驗(yàn)前、后各組大鼠體重的變化實(shí)驗(yàn)前，各組大鼠體重?zé)o顯著差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后正常組體重明顯增長(zhǎng)較其他各組有顯著性差異(P<0.05)，其中增長(zhǎng)最少的是蘇-7-2.0 g組，依次為模型組、蘇-7-0.5 g組、補(bǔ)佳樂(lè)組、蘇-7-1.0 g組。蘇-7-1.0 g組與模型組及蘇-7-2.0 g組比較體重有顯著性差異(P<0.05)，其余均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)表 1。這表明蘇-7-2.0 g劑量給藥時(shí)其胃腸道功能受影響，消化功能會(huì)下降，而進(jìn)食量下降體重增長(zhǎng)也最緩慢，也就是說(shuō)隨著劑量的加大它的胃腸道負(fù)荷增加，副反應(yīng)也會(huì)增加。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠各臟器重量變化實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，與正常組相比模型組的卵巢重量及脾臟重量明顯下降(P<0.05)；蘇-7-0.5 g組大鼠卵巢重量及脾臟重量與模型組相比明顯增加(P<0.05)。其余組無(wú)明顯差異(P>0.05)。說(shuō)明低劑量蘇-7-0.5 g可能具有保護(hù)卵巢和脾臟，提高免疫力的作用，中劑量蘇-7-1.0 g可能具有增加體重作用。而蘇-7-2.0 g組與CTX 組相比大鼠體重及各臟器均無(wú)顯著差異(P>0.05)。通過(guò)對(duì)大鼠卵巢、肝、脾、腎以及子宮各個(gè)臟器重量的比較，發(fā)現(xiàn)腎臟、肝臟和子宮在各組之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但卵巢、脾臟在各組大鼠之間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)表 1。

表1 干預(yù)結(jié)束后各組大鼠體重，臟器重量比較

2.4 蘇格木勒-7對(duì)化療性卵巢功能低下大鼠性激素水平及AMH的影響檢測(cè)各組大鼠血清中性激素水平和動(dòng)情周期。蘇-7 治療 15天時(shí)，治療組大鼠 AMH 水平顯著下降(P<0.05)。中劑量蘇-7-1.0 g組與模型組、補(bǔ)佳樂(lè)組比較 AMH 顯著增高(P<0.01，P<0.05)；低劑量蘇-7-0.5 g組與模型組比較AMH 也顯著增高(P<0.05)，中劑量蘇-7-1.0 g組作用較強(qiáng)。低劑量組能明顯增高雌二醇(E2)水平，與其他 5 組相比均有顯著差異(P<0.05)；模型組促卵泡激素(FSH)與正常組相比反而明顯降低(P<0.01)，其他各組間均無(wú)顯著差異；用蘇-7 治療 15天時(shí)提高 AMH 水平效果最佳，見(jiàn)表2。

表2 蘇-7 治療 15天的各組大鼠 AMH、E2、FSH 比較

蘇-7 治療 24天時(shí)，模型組與正常組比 AMH、E2、FSH 均無(wú)顯著差異(P>0.05)；這與后期的卵泡形態(tài)學(xué)檢測(cè)及卵泡計(jì)數(shù)時(shí)看到的治療組的竇狀卵泡數(shù)增高結(jié)果相吻合。蘇-7 高、中劑量組分別與正常組及補(bǔ)佳樂(lè)組及模型組比 AMH 均增高，但無(wú)顯著性差異(P>0.05);蘇-7 中劑量組分別與補(bǔ)佳樂(lè)組及正常組及模型組比 E2 均增高，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)；FSH 六組間相比，均無(wú)顯著差異(P>0.05)。這可能與此時(shí)模型的內(nèi)分泌功能已經(jīng)恢復(fù)，蘇-7藥效最佳時(shí)間已過(guò)有關(guān)，見(jiàn)表 3。

表3 蘇-7 治療24天的各組大鼠 AMH、E2、FSH 比較

2.5 蘇格木勒-7 對(duì)化療性卵巢功能低下大鼠動(dòng)情周期的影響顯微鏡下正常動(dòng)情周期各階段的細(xì)胞特征及比例見(jiàn)圖1。正常組大鼠表現(xiàn)出規(guī)律的動(dòng)情周期，并且動(dòng)情周期的每個(gè)階段持續(xù)的時(shí)間都是正常的，化療后大鼠動(dòng)情周期均出現(xiàn)紊亂或無(wú)動(dòng)情期，具體表現(xiàn)在 50%的大鼠動(dòng)情周期紊亂，不規(guī)律，而 50%的大鼠無(wú)動(dòng)情期；三種劑量的蘇-7 治療 13-22 天后大鼠 93.9%恢復(fù)正常動(dòng)情期；最后實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)模型組41.6%大鼠停止動(dòng)情 8 天后自然恢復(fù)動(dòng)情期，58.4%的大鼠未能恢復(fù)動(dòng)情期。和模型組相比三種劑量的蘇-7 組大鼠恢復(fù)動(dòng)情期(正常性周期)比率有顯著差異(P<0.01)，見(jiàn)表4。

圖1 大鼠不同動(dòng)情周期陰道細(xì)胞圖×100(注：A：動(dòng)情前期 B：動(dòng)情期 C:動(dòng)情后期 D：動(dòng)情間期)

表4 各組恢復(fù)動(dòng)情期比率比較

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，CTX對(duì)大鼠卵巢造成了損傷而出現(xiàn)卵巢早衰，三種劑量的蘇-7治療能保護(hù)或修復(fù)卵巢損傷，恢復(fù)大鼠卵巢的排卵，恢復(fù)正常的動(dòng)情周期，因動(dòng)情周期恢復(fù)正常，說(shuō)明卵巢內(nèi)分泌功能及生殖能力恢復(fù)正常。

2.6 蘇格木勒-7對(duì)化療性卵巢功能低下大鼠卵巢儲(chǔ)備的影響本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了大鼠的卵巢儲(chǔ)備以及卵泡的發(fā)育及形態(tài)學(xué)變化。進(jìn)行了各級(jí)卵泡的數(shù)量統(tǒng)計(jì)，觀察各組卵巢形態(tài)。

2.6.1各級(jí)卵泡計(jì)數(shù)情況 卵泡計(jì)數(shù)方法詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方法部分。由于CTX對(duì)生長(zhǎng)卵泡的毒性損傷及始基卵泡池激活，CTX 后各級(jí)卵泡數(shù)目均減少，其中竇狀卵泡與正常組比顯著下降(P<0.05)，而閉鎖卵泡顯著增加(P<0.01)，卵果內(nèi)分泌和生殖功能下降。在本研究中，CTX 組小鼠各級(jí)卵泡計(jì)數(shù)結(jié)合前述低雌激素水平和 AMH 下降及后面的生殖功能，說(shuō)明成功建立了化療致卵巢損傷模型。蘇-7 高中低劑量組及補(bǔ)佳樂(lè)組大鼠竇狀卵泡數(shù)目和模型組相比顯著增高(P<0.05)，三種劑量蘇-7 組大鼠閉鎖卵泡數(shù)目與模型組相比顯著減少(P<0.05)，而三種劑量蘇-7 對(duì)原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡數(shù)目和正常組及 CTX 組相比未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；見(jiàn)表5。

表5 治療結(jié)束后各組大鼠卵巢各級(jí)卵泡數(shù)(每張切片)比較(個(gè)，

2.6.2各組卵巢形態(tài)變化 光鏡下觀察了各組卵巢的形態(tài)學(xué)改變。正常組：卵巢組織中皮質(zhì)未見(jiàn)明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化；CTX 組：卵巢略萎縮，結(jié)構(gòu)完整，各級(jí)卵泡數(shù)少，各級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞層次減少，部分卵泡發(fā)育不良，囊性擴(kuò)張的卵泡增多，其內(nèi)卵母細(xì)胞消失，皮質(zhì)增厚，髓質(zhì)少，間質(zhì)內(nèi)纖維結(jié)締組織增生及灶狀淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；中劑量蘇-7組：卵巢結(jié)構(gòu)正常，皮質(zhì)略增厚，髓質(zhì)少，見(jiàn)各級(jí)卵泡及黃體，間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；高劑量蘇-7組：卵巢結(jié)構(gòu)正常，皮質(zhì)略增厚，髓質(zhì)少，見(jiàn)黃體及各級(jí)卵泡，其中竇狀卵泡相對(duì)增多或竇狀卵泡增生為主；低劑量蘇-7組：卵巢結(jié)構(gòu)正常，皮質(zhì)略增厚，髓質(zhì)少，間質(zhì)血管充血，見(jiàn)黃體及各級(jí)卵泡，顆粒細(xì)胞層增多，竇狀卵泡增生為主；補(bǔ)佳樂(lè)組：卵巢結(jié)構(gòu)完整，各級(jí)卵泡數(shù)均少，皮質(zhì)增厚，髓質(zhì)少，間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；見(jiàn)圖2。

圖2 顯示各組大鼠卵巢形態(tài)(A-F依次顯示正常、模型、蘇-7-2.0、蘇-7-1.0、蘇-7-0.5、補(bǔ)佳樂(lè)組大鼠卵巢形態(tài))

2.7 蘇格木勒-7對(duì)化療性卵巢功能低下大鼠生育能力的影響正常組大鼠生育率 100%，每窩新生鼠數(shù)量 11±1.0 只，而且全部生存且正常生長(zhǎng)。模型組大鼠生育率 25%，每窩新生鼠數(shù)量 8.5±1.5 只，但新生鼠出生后 5-7 天全部死亡。蘇-7 高劑量組生育率 50%，每窩新生鼠數(shù)量分別 8.5±1.5只，生存率 95%。蘇-7 中劑量組生育率 100%，每窩新生鼠數(shù)量分別 8.5±1.5只，而且全部生存，正常生長(zhǎng)。蘇-7 低劑量組生育率 75%，每窩新生鼠數(shù)量分別 8.5±1.5只，生存率 96.2%。補(bǔ)佳樂(lè)組的生育率 50%，每窩新生鼠數(shù)量 9.8±1.0 只，但新生鼠出生后 5-7 天全部死亡；見(jiàn)表6。

表6 蘇-7 對(duì)大鼠生殖功能的影響

3 討論

卵巢是女性激素產(chǎn)生的重要器官，具有內(nèi)分泌和生殖功能，對(duì)女性的內(nèi)分泌生殖起著非常重要的作用，卵巢損傷引起的卵巢功能下降及卵巢功能提前衰退，將不可避免的過(guò)早絕經(jīng)以及生殖能力的喪失[5]，前期諸多研究已經(jīng)證實(shí)CTX能引起67%的生育期女性絕經(jīng)[6-9]，還有一項(xiàng)重要的發(fā)現(xiàn)是，完整的化療方案后只有0.6%的女性可以懷孕[10-11]，本研究模擬了卵巢功能下降及卵巢早衰。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CTX組比正常組大鼠卵巢萎縮，卵巢重量明顯下降，卵巢內(nèi)分泌功能及生殖能力均明顯下降，采用中低劑量的蘇-7治療之后，與CTX組及補(bǔ)佳樂(lè)組相比大鼠內(nèi)分泌功能和生殖能力均顯著提高，如：中低劑量的蘇-7組血清雌二醇水平上升、AMH水平上升、大鼠動(dòng)情周期恢復(fù)正常的比例顯著增加、顯微鏡下卵巢組織竇狀卵泡數(shù)明顯增加、閉鎖卵泡數(shù)下降、大鼠生育率及新生鼠生存率極顯著提高。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)得出，該藥具有保護(hù)化療模型大鼠體重、卵巢及脾臟作用，能提高免疫力，保護(hù)卵巢功能。抵抗卵巢損傷及促進(jìn)卵巢修復(fù)、促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育成熟及排卵而恢復(fù)動(dòng)情周期、提高生殖能力及提高新生鼠的生存能力。其中低劑量的蘇-7防治化療性卵巢功能低下作用優(yōu)于補(bǔ)佳樂(lè)，而且低劑量蘇-7療效更佳。