楊 菁，曹羅元，董文婿，林應(yīng)華，黃寶英，富顯果*

(1.寧德師范學(xué)院附屬寧德市醫(yī)院 細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,福建 寧德352100；2.福建省病原真菌與真菌毒素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(福建農(nóng)林大學(xué))，福建 福州350002)

黃綠青霉素(CIT)是由于大米、玉米等糧食作物和飼料發(fā)霉而產(chǎn)生的一種具有很強(qiáng)生物活性的次級代謝產(chǎn)物，主要由黃綠青霉菌、赭鮭色正青霉菌及土霉菌產(chǎn)生[1-2]。世界上有許多國家和地區(qū)以大米為主要糧食，不當(dāng)?shù)膬?chǔ)存條件如潮濕、時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致黃綠青霉菌迅速生長，產(chǎn)生大量的CIT。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)估計(jì)，全球約有1/4-1/3的谷物受到真菌毒素的污染，飼料污染的情況則更為嚴(yán)重[3]，CIT是造成污染的真菌毒素之一，因此，這是一個(gè)不可忽視的公共衛(wèi)生問題。毒理學(xué)研究表明，CIT對人和動(dòng)物(包括小鼠、大鼠、兔子等)有急性神經(jīng)毒性作用，如體溫降低、呼吸衰竭、循環(huán)衰竭、麻痹和抽搐等[4]，但其具體作用機(jī)制并不明確。目前，氧化應(yīng)激反應(yīng)被認(rèn)為是神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能損傷的重要誘因，常常與某些神經(jīng)性疾病病因相關(guān)[5]。已有的研究中，Yuntao Bai[6]等人通過檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)和還原型谷胱甘肽(GSH)的生成，證實(shí)了CIT能夠誘導(dǎo)人肝源性肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞的DNA損傷，最有可能是通過氧化應(yīng)激機(jī)制進(jìn)行的。因此，本研究通過將CIT作用于神經(jīng)細(xì)胞PC-12，檢測細(xì)胞活性及相應(yīng)的氧化應(yīng)激指標(biāo)，明確黃綠青霉素是否通過氧化應(yīng)激機(jī)制損傷神經(jīng)細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo、BB15)，全波長酶標(biāo)儀(Molecular Devices、SPECTRA MAX 190)，低溫高速離心機(jī)(Beckman、Allegra X-22R)，倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS、IX71)。

黃綠青霉素(純度≥97%，貨號ALX-630-118-M001，購于ENZO公司)，MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、PBS緩沖液(Hyclone)，胰酶(Gibco)，CCK-8試劑盒、脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、一氧化氮(NO)試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、NP-40裂解液(碧云天)，ROS試劑盒、GSH試劑盒、SOD檢測試劑盒(南京建成)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

PC-12細(xì)胞(鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞)，購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。PC-12細(xì)胞用含10%FBS的MEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入CIT，除LDH檢測采用無血清培養(yǎng)基加CIT，其余實(shí)驗(yàn)均用含10%FBS的培養(yǎng)基加CIT，共培養(yǎng)時(shí)間均為 24 h，參照Yuntao Bai[6]與Yuexia Wang[7]，將實(shí)驗(yàn)分為四組：低劑量組(CIT濃度2.5 μmol/L)，中劑量組(CIT濃度5 μmol/L)，高劑量組(CIT濃度10 μmol/L)，空白對照組用DMSO處理，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活性

將PC-12細(xì)胞濃度調(diào)整為5×107個(gè)/L，每孔100 μl接種至96孔板，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁，加入不同濃度CIT再共培養(yǎng)24 h。檢測時(shí)加入10 μl CCK-8溶液，放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，450 nm測吸光度。對照組存活率設(shè)為100%，藥物組存活率=測定OD值/對照OD值。

1.4 LDH釋放率檢測

PC-12細(xì)胞濃度為5×107個(gè)/L，每孔100 μl接種至96孔板，24 h后細(xì)胞貼壁，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗一次。換成200 μl無血清培養(yǎng)液，加入不同濃度CIT，共培養(yǎng)24 h。到檢測時(shí)間前1 h，在“樣品最大酶活性對照孔”中加入20 μl LDH釋放試劑，混勻后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。到達(dá)檢測時(shí)間，取細(xì)胞培養(yǎng)液在400 g離心5 min。每孔取上清液120 μl，加到新的96孔板，各孔分別加入60 μl LDH檢測工作液，混勻，室溫避光孵育30 min。490 nm處測定吸光度，600 nm作為參考波長進(jìn)行雙波長測定。LDH釋放率=(樣品孔OD值-背景空白對照孔OD值)/(最大酶活性對照孔OD值-最大酶活性空白孔OD值)，ΔLDH 釋放百分率=樣品組LDH 釋放百分率-空白對照組 LDH 釋放百分率。

1.5 MDA、ROS、NO含量檢測

PC-12細(xì)胞接種至六孔板，每孔細(xì)胞數(shù)1×106個(gè)，每孔2 ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度CIT共培養(yǎng)24 h。細(xì)胞培養(yǎng)液1 500 g離心5 min，取上清液加入MDA檢測試劑混勻，沸水浴15 min，532 nm測吸光度，計(jì)算MDA含量。

培養(yǎng)液換成2 ml無血清培養(yǎng)基，一組正常培養(yǎng)的細(xì)胞不加探針，只加培養(yǎng)基設(shè)為陰性對照，一組正常培養(yǎng)的細(xì)胞加入供氫體(終濃度24 μmol/L)設(shè)為陽性對照孔，所有孔都加入DCFH-DA探針(終濃度10 μmol/L)，37℃培養(yǎng)箱孵育30 min到1 h，吸去培養(yǎng)液，加入PBS將細(xì)胞吹打下來，再用PBS洗1-2遍，離心去上清收集沉淀，按照FITC熒光檢測條件檢測ROS熒光值。

細(xì)胞濃度為5×107個(gè)/L，每孔100 μl接種至96孔板，貼壁生長24 h后，加入不同濃度CIT，共培養(yǎng)24 h。取細(xì)胞培養(yǎng)液在400 g離心5 min。每孔取50 μl在新的96孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品及樣品，然后加入檢測試劑，在540 nm處測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線計(jì)算出樣品中NO的濃度。

1.6 GSH含量、SOD活力的檢測

PC-12細(xì)胞接種至六孔板，每孔細(xì)胞數(shù)1×106個(gè)，每孔2 ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度CIT共培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，用冰浴過的PBS洗3遍，加入NP-40裂解液(PMSF終濃度為1 mM)，4℃裂解30 min，4℃下3 500 g離心10 min，取100μl上清液按照GSH檢測試劑盒說明書，420 nm處測定吸光度，用BCA蛋白定量試劑盒定量，GSH含量(μmol/gprot)=(樣品孔OD值-空白孔OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)孔OD值-空白孔OD值)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(20 μmol/L)×樣本前處理稀釋倍數(shù)(2)÷待測樣本蛋白濃度(gprot/L)。

按照SOD檢測試劑盒說明書，450 nm處測定吸光度，SOD 抑制率(%)=[(對照孔OD值-對照空白孔OD值)-(樣品孔OD值-樣品空白孔OD值)]/(對照孔OD值-對照空白孔OD值)×100%，SOD活力(U/mgprot)=SOD 抑制率÷50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)(0.24 ml/0.02 ml)÷待測樣本蛋白濃度(mgprot/mL)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 黃綠青霉素對細(xì)胞形態(tài)的影響

CIT處理PC-12細(xì)胞24 h后，細(xì)胞出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。隨著CIT濃度的增大，細(xì)胞聚集成團(tuán)的程度也越高，并開始脫落，出現(xiàn)空斑，而對照組未出現(xiàn)明顯變化。見圖1。

圖1 黃綠青霉素對PC-12細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)

2.2 CIT抑制細(xì)胞活性

隨著CIT濃度的增大，細(xì)胞活力明顯下降，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，所有的CIT組與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明CIT能夠明顯抑制細(xì)胞活性。見圖2。

圖2 CIT對細(xì)胞活性的影響

2.3 CIT對LDH釋放率的影響

與對照組相比，所有CIT處理組的LDH釋放率均明顯升高(P<0.01)。見表1。

表1 CIT對LDH釋放率的影響

2.4 CIT對MDA、ROS、NO含量的影響

與對照組相比，CIT組的MDA含量均顯著升高(P<0.01)，見圖3；ROS含量均比對照組顯著升高，在2.5 μmol/L和5 μmol/L組中效果極為顯著(P<0.01)，10 μmol/L組中效果較為顯著(P<0.05)，見圖4；隨著CIT濃度增大，細(xì)胞外的NO含量下降，呈劑量效應(yīng)關(guān)系。與對照組相比，2.5 μmol/L組及5 μmol/L組下降顯著(P<0.05)，10 μmol/L組下降的極為顯著(P<0.01)，見圖5。

圖3 CIT對MDA含量的影響

圖4 CIT對 ROS含量的影響 圖5 CIT對NO含量的影響

2.5 CIT對GSH含量、SOD活力的影響

細(xì)胞內(nèi)的GSH含量隨CIT濃度增大呈下降趨勢，在2.5 μmol/L和5 μmol/L組中效果不顯著(P>0.05)，10 μmol/L組中效果顯著(P<0.05)，見圖6。

圖6 CIT對GSH含量的影響 圖7 CIT對SOD活力的影響

細(xì)胞內(nèi)的SOD活力隨CIT濃度增大而上升，各組與對照組比較均有極顯著差異(P<0.01)，2.5 μmol/L組、5 μmol/L組與10 μmol/L組之間比較無明顯差異(P>0.05)。見圖7。

3 討論

本研究采用LDH法檢測黃綠青霉素對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用，LDH在胞漿內(nèi)含量豐富，正常時(shí)不能通過細(xì)胞膜，只有在細(xì)胞受損傷或死亡時(shí)才被釋放到細(xì)胞外，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性與細(xì)胞死亡數(shù)成正比。因此，LDH釋放被看做細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，被用于細(xì)胞毒性檢測。當(dāng)ΔLDH 釋放百分率≤20%，表明存在細(xì)胞輕度損傷，當(dāng)ΔLDH釋放百分率為20%-50%時(shí)則為細(xì)胞中度損傷，而當(dāng)ΔLDH釋放百分率≥50%時(shí)，則表明存在細(xì)胞重度損傷[8]。結(jié)合CCK-8結(jié)果，提示CIT對細(xì)胞有明顯的損傷作用，并能夠抑制細(xì)胞活性。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是由于自由基過度產(chǎn)生無法及時(shí)清除，體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，導(dǎo)致機(jī)體的細(xì)胞和組織被損傷[9]，是應(yīng)激性損傷的主要機(jī)制之一[10]。MDA是重要的氧自由基代謝產(chǎn)物，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，其氧化最終產(chǎn)物就是MDA，因此，MDA的含量可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度，間接反應(yīng)細(xì)胞損傷的程度。ROS是有氧代謝的副產(chǎn)物，正常狀態(tài)下，ROS的產(chǎn)生與消耗處于平衡狀態(tài)[11]。但當(dāng)機(jī)體受到各類有害刺激時(shí)，機(jī)體內(nèi)ROS生成量增加，從而與體內(nèi)抗氧化體系發(fā)生持續(xù)失衡，導(dǎo)致組織損傷[10]。

NO是一種反應(yīng)性極強(qiáng)的自由基，起到神經(jīng)遞質(zhì)和信號分子的作用，能夠反應(yīng)氧化應(yīng)激的水平，參與多種生理和病理過程[12]。在合成NO的過程中，電子從一個(gè)單二聚體上的黃素還原酶結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移到另一個(gè)單二聚體的氧化酶結(jié)構(gòu)域，后者包含一個(gè)鐵結(jié)合血紅素活性位點(diǎn)。在血紅素位點(diǎn)，電子被用來還原和激活O2，O2又氧化生成NO，這個(gè)過程需要結(jié)合四氫生物蝶呤(BH4)進(jìn)行偶聯(lián)，ROS可使BH4氧化導(dǎo)致解偶聯(lián)，使O2轉(zhuǎn)化為超氧化物自由基，降低NO生成量[13]。本研究結(jié)果表明，CIT能顯著提高細(xì)胞外MDA含量，在CIT濃度為5 μmol/L后，MDA含量就基本不變，這提示了CIT在低劑量就能夠引起脂質(zhì)氧化；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明CIT顯著提高細(xì)胞內(nèi)ROS含量，說明CIT能夠引起細(xì)胞氧化體系失衡；CIT會(huì)降低細(xì)胞外NO含量，進(jìn)一步提示可能因?yàn)镽OS含量增多引起的NO減少。

目前機(jī)體對抗氧自由基主要依賴自身的抗氧化酶系統(tǒng)，其中 SOD 和 GSH 是機(jī)體主要的抗氧化酶[14]。GSH能夠與體內(nèi)的自由基結(jié)合使其轉(zhuǎn)化為代謝的酸類物質(zhì)，同時(shí)也可以加速自由基的排泄和保護(hù)器官避免受到損傷[15]。SOD 能夠維持細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu)和功能，通過歧化作用降低體內(nèi)過多的氧自由基，減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[16]，維持細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化平衡，SOD 活力的高低反映的是機(jī)體抗氧化應(yīng)激的能力[17]。有研究報(bào)道，在氧化應(yīng)激的刺激下，細(xì)胞內(nèi)為了處理過量的ROS，SOD的合成量會(huì)上升[18]。本研究結(jié)果表明，CIT處理細(xì)胞后，GSH水平呈下降趨勢，并在高劑量時(shí)顯著下降；各劑量組SOD的活力均顯著升高，這些結(jié)果都提示了CIT能降低細(xì)胞清除自由基的能力。

4 結(jié)論

黃綠青霉素能夠抑制PC-12細(xì)胞活性，并降低LDH釋放率及NO含量，對細(xì)胞具有明顯毒性作用；細(xì)胞外的MDA、細(xì)胞內(nèi)ROS水平和SOD活力顯著上升，細(xì)胞內(nèi)GSH含量呈下降趨勢。因此，黃綠青霉素能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，其分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。