邱 實(shí),陳 坤,衣 琳,于越海

(1.吉林化工醫(yī)院 a.放化療科;b.老年病科，吉林 吉林132000；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 泌尿外科)

腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)是最常見的腎惡性腫瘤[1]，但由于缺乏特異性的生物標(biāo)志物，目前臨床上對(duì)于ccRCC預(yù)后的判斷仍然依賴患者或腫瘤的臨床和病理特征。尋找一種有效的生物標(biāo)志物對(duì)于ccRCC患者的術(shù)后檢測以及管理至關(guān)重要[2]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)已經(jīng)被證明在腎細(xì)胞癌患者的早期診斷和預(yù)后中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[3-4]。血漿游離核酸(cfDNA和cfRNA)比CTC的檢測更簡單，且重復(fù)性更高。甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為管家基因(housekeeper gene)，多用于測定其他基因轉(zhuǎn)錄或蛋白表達(dá)的內(nèi)參。最近一些研究發(fā)現(xiàn)，GAPDH[LS4]也可以作為一種獨(dú)立的腫瘤生物標(biāo)志物[5]。本研究擬觀察ccRCC患者術(shù)前血漿中GPADH的cfDNA和cfRNA對(duì)診斷及預(yù)后的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料納入2015年1月至2015年6月，于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院泌尿外科行手術(shù)治療的腎透明細(xì)胞癌患者50例，收集患者的性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期、Fuhrman分級(jí)等臨床病理特征，并于手術(shù)前采集外周血標(biāo)本。另收集同期20例健康人的外周血標(biāo)本。

1.2 血標(biāo)本處理方法每例外周血標(biāo)本約10 ml，用含EDTA的采血管收集。收集后立刻1 500 rpm離心10 min，小心將上層血清轉(zhuǎn)移至新的、無DNA酶和RNA酶的離心管中，再次2 000 rpm離心10 min，收集上層血漿標(biāo)本，置于-80℃冰箱中保存。所有離心操作，離心機(jī)溫度均為4℃。

1.3 血漿cfDNA和cfRNA的提取本次研究應(yīng)用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit試劑盒(QIAGEN,德國，貨號(hào)：55114)提取血漿中的cfDNA和cfRNA。分別取1 ml血漿標(biāo)本，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取得到cfDNA后，置于-20℃冰箱中保存。提取得到cfRNA后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將cDNA置于-20℃冰箱中保存。

1.4 DNA與cDNA的量化應(yīng)用熒光雜交探針對(duì)提取的DNA和cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)，擴(kuò)增GAPDH與hTERT的特異性序列。GAPDH正向引物序列為：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，反向引物序列為：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。應(yīng)用TaqMan探針進(jìn)行定量，探針序列為：5’-FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA。構(gòu)建10 μl的RT-qPCR體系：cDNA模板1 μl，正反引物各0.2 μl，Mix 5 μl，染料(50×)0.2 μl，最后用無酶水補(bǔ)齊至10 μl。循環(huán)數(shù)為45，PCR條件：95℃ 10 min后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，95℃ 15s，60℃ 60 s，45個(gè)循環(huán)后，95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s，后冷卻至4℃。

1.5 復(fù)查與隨訪方法患者術(shù)后前2年，每3個(gè)月復(fù)查一次，第3年至第5年，每半年復(fù)查一次。復(fù)查內(nèi)容包括體格檢查、血常規(guī)、血生化、腫瘤標(biāo)志物、超聲、CT等。隨訪采用電話或門診隨訪。總生存期(Overall Survival，OS)定義為自手術(shù)次日至患者死亡，或最后一次隨訪。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 24.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)的形式表示。計(jì)量資料兩組間比較采用Student’st檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。Kaplan-Merier法計(jì)算OS、CSS和PFS。以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床病理資料納入50例ccRCC患者中，男性36例(72%)，平均年齡(66.3±7.6)歲；20例健康人中，男性13例(65%)，平均年齡(63.6±8.1)歲。兩組在性別組成和平均年齡上無顯著差異(P>0.05)。ccRCC患者病理資料見表1。

表1 一般臨床資料

2.2 術(shù)前血漿cfDNA與cfRNA在診斷中的價(jià)值在所有ccRCC患者和健康人的血漿中均檢測到了GAPDH的cfDNA和cfRNA。在ccRCC患者和健康人血漿中，GAPDH的cfDNA平均濃度分別為(30.63±28.18)fg/ml和(1.35±1.68)fg/ml，兩組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。以1.35 fg/ml作為診斷臨界值，其靈敏度為91.49%，特異度為69.57%。ROC曲線下面積(AUC)為0.897(0.825-0.969；P<0.001)。

在ccRCC患者和健康人血漿中，GAPDH的cfRNA平均濃度分別為(109.68±85.45)fg/ml和(17.84±7.48)fg/ml，兩組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，以17.84 fg/ml作為診斷臨界值，其靈敏度為81.25%，特異度為50%。ROC曲線下面積(AUC)為0.811(0.712-0.910；P<0.001)。

2.3 術(shù)前血漿cfDNA與cfRNA水平與腫瘤病理參數(shù)的關(guān)系ccRCC患者術(shù)前血漿GAPDH cfDNA水平與T分期和TNM分期有關(guān)，T3-T4期和Ⅲ-Ⅳ期患者血漿GAPDH cfDNA水平顯著高于T1-T2期和Ⅰ-Ⅱ期患者。而cfRNA水平與T分期、N分期、M分期和TNM分期均呈正相關(guān)。見表2。

表2 術(shù)前血漿cfDNA與cfRNA水平與腫瘤病理參數(shù)的關(guān)系

2.4 術(shù)前血漿cfDNA與cfRNA水平與預(yù)后的關(guān)系多因素COX回歸分析結(jié)果提示，M分期、TNM分期，以及術(shù)前GAPDH cfDNA和cfRAN水平是影響ccRCC患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M1期)、高TNM分期與較差的OS有關(guān)，而且，術(shù)前GAPDH cfDNA每升高1 fg/ml，死亡風(fēng)險(xiǎn)增加3.1%，GAPDH cfRNA每升高1 fg/ml，死亡風(fēng)險(xiǎn)增加4.2%。見表3。

表3 影響OS的多因素回歸分析

3 討論

目前，血漿cfNA在臨床中的價(jià)值已經(jīng)在多種腫瘤中得到證實(shí)[6-7]，但在腎透明細(xì)胞癌中的研究相對(duì)較少?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，腎細(xì)胞癌(RCC)患者血漿中中-小片段cfDNA水平與健康者無顯著差異，但大片段cfDNA水平要顯著高于健康人群，尤其是發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者[8-9]。

本研究發(fā)現(xiàn)術(shù)前ccRCC患者血漿中GAPDH cfDNA與cfRNA水平較健康人群顯著升高，這為以這兩種分子作為診斷工具提供了可能。本研究以GAPDH cfDNA與cfRNA在健康人血漿中的平均水平作為臨界值，當(dāng)用cfDNA進(jìn)行診斷時(shí)，靈敏度高達(dá)91.49%，但特異度較差，為69.57%；當(dāng)用cfRNA 進(jìn)行診斷時(shí)，靈敏度為81.25%，但特異度僅為50%。關(guān)于血漿cfNA作為診斷工具的靈敏度和特異度，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道差異較大。造成這種差異的原因可能與腫瘤異質(zhì)性、檢測方法、甚至是引物序列有關(guān)[3]。本研究中cfNA的特異度均不理想，除了上述原因之外，也可能與樣本量較少有關(guān)，尤其是健康人群數(shù)量較少，造成診斷范圍可能出現(xiàn)較大偏差。

本研究發(fā)現(xiàn)在T3-T4期和TNM Ⅲ-Ⅳ期的患者中，血漿cfDNA和cfRNA水平顯著升高，且cfRNA水平還與N分期和M分期顯著相關(guān)，但二者均與Fuhrman分級(jí)無顯著相關(guān)性。這與其他研究結(jié)果相似[10]。De Martino等研究認(rèn)為，cfDNA水平可能與腫瘤壞死相關(guān)，晚期腫瘤可能具有更大的腫瘤壞死面積，故造成血漿cfDNA水平升高[9]。

在預(yù)后方面，術(shù)前血漿中GAPDH cfNA水平是影響ccRCC患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。先前有研究發(fā)現(xiàn)，RCC患者術(shù)后血漿中cfDNA水平與復(fù)發(fā)和預(yù)后有關(guān)。本研究結(jié)果提示術(shù)前血漿GAPDH cfDNA和cfRNA可能對(duì)預(yù)后也有一定的預(yù)測價(jià)值。

綜上，術(shù)前血漿GAPDH cfDNA和cfRNA可以作為ccRCC的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。