蘇志國

（中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190）

2020 年9 月2 日，麻省理工學院（MIT）發(fā)布訃告，生物化學工程先驅、MIT 的學院教授（Institute Professor）王義翹（Daniel I.C.Wang）先生離世，終年84歲。MIT在訃告中，特地提到了王義翹先生創(chuàng)建MIT 生物技術過程工程中心（Biotechnology Process Engineering Center，BPEC）這一重大貢獻，因為BPEC 的創(chuàng)建、運行和成功凝聚著王義翹先生的智慧、心血和成果，是一座在美國乃至世界生物技術發(fā)展中有重大影響的歷史豐碑［1］。

我于1990—1992 年在MIT BPEC 作訪問學者，親身體驗到王義翹先生的遠見卓識、敢為人先的精神理念、廣闊深厚的專業(yè)功底，以及他領導下BPEC 的尖端研究、協(xié)同創(chuàng)新、濃厚氛圍與合作機遇，受益匪淺，并給予我后面的科研生涯和擔任國家重點實驗室主任工作以重大的影響。值此紀念王義翹先生之際，我從自己的視角記敘和評論BPEC 的歷史背景、突出貢獻、創(chuàng)新機制和產(chǎn)生的影響，希望能讓同行更多了解王先生的巨大貢獻，汲取其中有參考價值的內涵。

1 引領生物化學工程進入生物制藥新時代

生物化學工程（簡稱生化工程）學科起源于20 世紀60 年代，最初的側重點是將化學工程技術應用于抗生素、食品和生物基化學品的發(fā)酵生產(chǎn)。隨著70～80 年代化石資源緊缺現(xiàn)象的出現(xiàn)，采用微生物和酶催化轉化木質纖維素等可再生資源為生物燃料成為生化工程研究的熱點。一些高校和科研單位相繼建立了生物質轉化研究中心，例如美國普渡大學在1978 年就建立了著名的可再生資源工程實驗室（LORRE），對農(nóng)作物廢棄物如秸稈纖維素轉化為清潔能源開展了系統(tǒng)的研究。

但與此同時，生物領域基因工程的發(fā)展日新月異，一大批以前只能靠從天然組織或細胞中提取的生物大分子藥物如疫苗抗原、蛋白質、細胞因子、多肽、核酸等，可以通過基因工程改造動物、植物和微生物細胞，然后通過大規(guī)模細胞培養(yǎng)獲得，從而開辟了生物制藥的新時代。很遺憾的是這一令人振奮的領域最初卻沒有工程科學家的參與。例如，由生物學家和投資人興辦的一些生物高技術公司采用的動物細胞培養(yǎng)方法是一個個裝有細胞和培養(yǎng)液的瓶子，即所謂的“滾瓶”，其材料、設備和人工成本非常高，生產(chǎn)效率低下，還容易受到污染，批次重復性和產(chǎn)品質量難以保證。

當時，王義翹先生作為著名的生化工程教授，已經(jīng)在微生物發(fā)酵領域取得了令人矚目的成果，但他敏銳地感覺到，用基因工程方法生產(chǎn)生物大分子藥物必須解決一系列前所未有的工程科學問題，這正是生化工程的機遇和挑戰(zhàn)。在他的積極申請和推動下，美國國家基金會（NSF）1985 年批準了麻省理工學院建立BPEC，成為世界上第1個由國家基金會資助的生化工程研究平臺［2］。

相比當時生化工程的主流觀念，BPEC 的設計思想有很大的轉變。如前所述，20 世紀80 年代初的生化工程是化學工程的一部分，其主流是通過微生物和酶催化的方法，利用可再生的資源來生產(chǎn)能源和化學品，解決石油煤炭日益緊張帶來的巨大資源壓力。但是，BPEC 瞄準的主要是生物大分子，進入的是生物制藥領域，在很多化工學者看來多少有些意外，甚至認為名不正言不順。另一方面，生物領域的很多專家也持懷疑態(tài)度，他們認為化學工程師不懂生物，不懂生物制藥，不適合加入基因工程藥物的研發(fā)大軍。對此，王義翹先生領導BPEC，用一系列的重大發(fā)現(xiàn)和發(fā)明論證了生化工程在基因工程藥物開發(fā)中的重大作用，確立了生化工程在生物技術中獨特的地位，即不僅研究化學產(chǎn)品的制造，還要研究包括蛋白質這樣復雜生物藥品的制造，而且其貢獻不可替代。

2 開啟動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)工程的研究

筆者開始在MIT 作訪問學者的時候，BPEC 已經(jīng)運行5年，渡過了最困難的起步階段，多項研究已經(jīng)取得了重要進展，其中令我印象最深刻的是動物細胞培養(yǎng)工程。

對當時大多數(shù)生化工程研究者來說，動物細胞培養(yǎng)似乎遙不可及，因為動物細胞比微生物細胞復雜，需要更多的細胞生物學知識。動物細胞株的獲得也比微生物菌株困難，特別是基因克隆表達方面還有大量未知的因素，技術上也遠不成熟。還有一個非常重要的問題是，動物細胞培養(yǎng)需要昂貴的設備、材料、營養(yǎng)（培養(yǎng)基）和環(huán)境，工程科學研究需要進行規(guī)模放大，需要的硬件和材料遠遠超過細胞生物學研究的尺度和數(shù)量，沒有經(jīng)費上的重大投入幾乎是不可能的。相比之下，研究基因工程微生物細胞的培養(yǎng)已具有很好的條件，并且工業(yè)部門也在開發(fā)相應的產(chǎn)品，有比較多的合作意向和需要解決的問題。除此之外，還有人推測微生物細胞由于各種培養(yǎng)上的優(yōu)點可以取代動物細胞作為基因工程產(chǎn)品的生產(chǎn)載體，沒有必要去研究成本非常高的動物細胞培養(yǎng)工程。

我第一次拜會王義翹先生的時候，就問了他上面提到的問題。他回答說：你說的確實是當今大多數(shù)生化工程研究者的觀點；但是作為一名學者，不能光看現(xiàn)在，要看長遠。動物細胞雖然相比微生物細胞培養(yǎng)更為困難，但大量結構復雜的蛋白質難以用大腸桿菌通過基因工程表達，只有通過動物細胞表達才能成功。例如，促紅細胞生成素只有用動物細胞才能做出具有生物活性的產(chǎn)品。但是動物細胞的大規(guī)模生產(chǎn)必須由化學工程師設計才能完成，因為這其中涉及更為復雜的反應控制，是前所未有的挑戰(zhàn)，用生物反應器取代滾瓶將是激動人心和令人鼓舞的研究領域。關于經(jīng)費問題，BPEC 除了從NSF獲得資助外，很大部分的研究經(jīng)費來源于制藥公司和生物技術企業(yè)，因為他們感覺到了動物細胞培養(yǎng)的重要和面臨的難題，需要化學工程師的加入。所以，BPEC 現(xiàn)在需要的是人才、強有力的團隊和科學與技術上的創(chuàng)新，拿出扎扎實實的動物細胞培養(yǎng)工程研究的結果。

王先生在幾次接待我國訪問團和學者的時候都談了上述觀點，令我印象深刻。將動物細胞培養(yǎng)工程作為工程中心研究的重點，通過生物、化學和工程學的交叉、融合進行創(chuàng)新，是BPEC 的亮點和成功之處。表1列出了王義翹先生指導的有關動物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)工程的幾篇有代表性的研究生學位論文或發(fā)表的文章。

表1 王義翹先生指導的有關動物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)工程有代表性的研究Tab.1 Representative research on large-scale culture of animal cells under guidance of Prof.Wang

這些研究設計精心，銜接緊密，框架清晰，可以歸納為3個主要方面：

（1）將化學工程的研究方法和理念應用于動物細胞培養(yǎng)中的流體力學分析，由此確定剪切環(huán)境對于動物細胞培養(yǎng)的作用和影響。其中胡維碩（Hu W.S.）的論文第1次對貼壁動物細胞在生物反應器中所受的傳質影響和液相剪切影響進行了分析［3］，闡述了在大規(guī)模培養(yǎng)中動物細胞出現(xiàn)死亡問題的原因。而邱紫文（Chiou T.W.）［4］的論文則從細胞固定化反應器設計著手，通過纖維床的設計，使得貼壁動物細胞有效地與纖維進行接觸，依附于纖維來保護自己免于液相剪切力的傷害，解決了以往貼壁細胞在反應器中失活的難題。

（2）將化學計量學的思維和概念應用于動物細胞培養(yǎng)中營養(yǎng)成分的設計，將培養(yǎng)基組成與最終細胞組分和代謝產(chǎn)物的關聯(lián)分析，成功建立了動物細胞培養(yǎng)過程中化學計量學方法的理念和方法。這項研究對后來無血清培養(yǎng)基的設計至關重要，而無血清培養(yǎng)基的設計是近年來動物細胞培養(yǎng)的一次革命。這項研究主要由謝良志（Xie L.Z.）完成［5］。他從細胞培養(yǎng)代謝的過程出發(fā)，設計了類似于微生物次生代謝產(chǎn)物控制的分批補料培養(yǎng)方法，將動物細胞反應器控制提高到代謝工程的水平［6］，為生物技術工業(yè)部門進行動物細胞培養(yǎng)過程控制補料策略奠定了基礎。

（3）將過程科學中的動態(tài)分析方法應用于反應器中的動物細胞培養(yǎng)，獲得了蛋白質翻譯后修飾隨時間變化的規(guī)律。與以往實驗室培養(yǎng)動物細胞的器皿不同，在生物反應器內，細胞受到各種剪切和營養(yǎng)限制，會導致部分細胞發(fā)生突變，產(chǎn)生糖基化不均一的蛋白質產(chǎn)物。王先生的團隊發(fā)現(xiàn)糖基化受三羧酸循環(huán)活性（TCA cycle activity）的影響，但不受糖酵解（glycosis）的影響，控制核苷酸糖的濃度是獲得均一糖基化的關鍵。這項研究是王先生指導博士生Nyberg G.完成的［7］。他們通過智能化動物細胞培養(yǎng)控制策略和優(yōu)化的反應器設計，將核苷酸糖（nucleotide sugar）濃度控制在優(yōu)化的水平上，有效避免或減少目標蛋白質的損失。

從以上3個方面可以看出王先生獨具匠心的設計。雖然細胞生物學家已經(jīng)做了大量動物細胞培養(yǎng)的研究，但卻缺少規(guī)?；瘲l件下和動態(tài)條件下的探索。動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)需要生物反應器，而反應器不同于培養(yǎng)皿和滾瓶，存在著時空多尺度效應。王先生帶領BPEC 從反應器流體力學分析開始，進入規(guī)?；磻鞯睦硇栽O計；從培養(yǎng)基組分與細胞組成和代謝的對應分析，進入微觀結構規(guī)律的考察；從環(huán)境變化的作用進入到基因和代謝層次的影響，發(fā)現(xiàn)導致糖基化不均勻的影響因素。整個研究框架實現(xiàn)了從基因到產(chǎn)品整個過程的系統(tǒng)化，構建了動物細胞培養(yǎng)工程的理論研究和技術開發(fā)的平臺。

圖1是王先生指導邱紫文在1990年設計的動物細胞纖維床反應器［4］。從中可以看出，設計者充分利用氣升環(huán)流生物反應器的構思，將反應器分為兩個區(qū)域：中心提升管為供氧區(qū)，這里可以通過氣體噴嘴的設計提升液體流動并向液體供氧；反應器的環(huán)隙為細胞生長區(qū)，這里動物細胞固定在有機纖維上，避免直接通入氣泡造成的損傷，同時又能從向下流動的培養(yǎng)液中獲得溶解氧。這項研究得到很多生物技術公司的重視，也得到了生物反應器制造廠家的重視。在纖維床的基礎上，各種新型的固定化動物細胞反應器得到了迅速的發(fā)展。

圖1 王義翹先生指導研究生設計的培養(yǎng)動物細胞的纖維床反應器Fig.1 Fiber bed bioreactor for animal cell culture that was designed by Prof.Daniel Wang and his students

多年以后，動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)已經(jīng)取代了基因工程微生物菌體培養(yǎng)的地位，成為生物制藥工程界最重要的方向和創(chuàng)新主流，特別是用中國倉鼠卵（CHO）細胞生產(chǎn)的多個單克隆抗體藥物，銷售額已經(jīng)全面超過化學藥物，進入全球藥物市場的前列。動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)從最初的滾瓶、微球載體培養(yǎng)，發(fā)展到流加、灌注培養(yǎng)，從有載體培養(yǎng)發(fā)展到無載體懸浮培養(yǎng)，再到各種一次性反應袋培養(yǎng)和膜分離耦合培養(yǎng)，成為生化工程最活躍的研發(fā)領域［8］。而這一切進展的科學基礎，離不開BPEC 在20 世紀90 年代到本世紀初開發(fā)的一系列動物細胞培養(yǎng)工程和理論，例如反應器內剪切力對動物細胞的作用，動物細胞在反應器內的代謝，培養(yǎng)基組分的動態(tài)需求與供給，時空條件下基因表達與糖基化的規(guī)律等。

3 激發(fā)生物大分子分離純化工程的創(chuàng)新思維

生物化學工程最明顯的特點之一是主要研究對象為超大的生物分子如各種酶、蛋白質藥物、核酸藥物、疫苗等。采用基因工程，細胞工程以及近年來的合成生物學工程等手段，已經(jīng)能夠在各種細胞或組織中表達生產(chǎn)這些生物大分子。但是從細胞和組織培養(yǎng)液中獲得純凈的生物大分子需要進行一系列的分離純化，去除各種各樣的雜質，包括雜蛋白、宿主核酸、脂多糖（熱原）以及其他容易引起免疫反應或副作用的組分。特別是用于醫(yī)藥工程的疫苗、抗體、細胞因子等，對安全性的要求極高，必須達到高純度高活性。因此分離純化的成本常常占整個生物大分子生產(chǎn)成本的70%～90%。

在化學工程中，分離工程被認為是最重要也是研究最多的領域之一。但是對于生物大分子來說，其空間或三維立體結構容易發(fā)生變化，導致生物活性的喪失。因此，加熱精餾、有機溶劑萃取、蒸發(fā)結晶這類化工中常用的分離手段在大分子生物化工中幾乎無法應用，但各種尺度的過濾（膜分離）、色譜分離（蛋白質色譜）卻大量使用。同時，還需要一些新的單元操作，如細胞破碎、蛋白質折疊、蛋白質修飾與組裝等，但是這些生物工業(yè)操作最初是從生物化學家建立的實驗室方法直接拓展的，并沒有上升到工程科學的水平。

王義翹先生是生化分離工程的開拓者之一。他很早就研究過用化工中泡沫浮選的方法從微生物發(fā)酵液中分離蛋白質［9］。建立BPEC 以后，他積極主張將生化分離工程作為動物細胞培養(yǎng)工程以外的另一個主攻方向，其中一個側重點就是蛋白質的重新折疊（refolding）。這實際上也與生物產(chǎn)業(yè)的需求密切相關，因為在當時除了動物細胞表達基因工程產(chǎn)品以外，用大腸桿菌表達基因工程蛋白質生產(chǎn)細胞因子正如火如荼地展開。但是大腸桿菌系統(tǒng)一個致命缺點是目標蛋白質很容易聚集在一起形成一種被稱為包涵體（inclusion body）的無活性顆粒。而要獲得有活性的蛋白質，必須用變性劑對包涵體進行溶解，再通過各種手段去除變性劑，讓蛋白質重新折疊成有活性的三維結構形式。但重新折疊的過程常常形成錯誤折疊和絮凝體沉淀，使得活性蛋白質的收率大大下降，而這其中的規(guī)律尚不知曉。

王先生指導研究生Cleland 進行蛋白質折疊規(guī)律的研究。他們很聰明地選擇了牛碳酸酐酶作為研究對象，因為這個酶沒有二硫鍵，省略了二硫鍵存在下進行折疊引起的麻煩，從而有利于探索蛋白質折疊恢復活性的動力學。與生物學家的探索不同，他們采用了化學動力學的方法探索在折疊產(chǎn)物形成的路途中存在的各種中間體［I］，如圖2 所示。其中［I1］、［I2］、［I3］代表不同的中間體。這些中間體不穩(wěn)定，可能變成錯誤折疊，而錯誤折疊和中間體也容易聚集。聚集體增多到一定階段溶液出現(xiàn)渾濁，生成蛋白質絮凝物發(fā)生沉淀，是折疊失敗的主要原因。因此，他們提出了穩(wěn)定中間體、避免錯誤折疊和聚集體產(chǎn)生的策略。其中的一個發(fā)明就是用聚乙二醇作為保護劑。他們發(fā)現(xiàn)，聚乙二醇分子能夠與碳酸酐酶折疊過程中的中間體形成相互作用，導致中間體被穩(wěn)定。這種穩(wěn)定作用與聚乙二醇的濃度和分子量相關。在有鹽酸胍變性劑存在的條件下，低濃度的聚乙二醇可以有效減少聚集體的形成。采用聚乙二醇為保護劑，他們不僅成功折疊了碳酸酐酶，還成功折疊了核糖核酸酶RNase，組織纖溶酶原激活劑tPA和γ-干擾素［10］。

圖2 蛋白質折疊過程機理：中間產(chǎn)物的存在及其形成錯誤折疊和聚集的可能Fig.2 Process mechanism of protein refolding:formation of intermediates and possibility of misfolding and aggregation

這項創(chuàng)新成果發(fā)表在Nature Biotechnology上［11］。由于這個期刊的讀者有很多生物學家和基因工程學家，亦有很多生物技術公司的研究人員，所以產(chǎn)生了非同一般的影響。蛋白質折疊在歷史上是生物化學家的研究領域，生物技術企業(yè)遇到包涵體蛋白質折疊的難題時習慣上也是找生物化學家來解決。但是工業(yè)大生產(chǎn)的條件與實驗室的容器操作差距很大，如何控制好局部蛋白質和變性劑的濃度至關重要，化學工程師則擅長處理這方面的難題，而MIT 建立的聚乙二醇輔助蛋白質折疊的策略更適合大規(guī)模操作。因此，各種輔助蛋白質折疊的人工“伴侶”（保護劑）隨后被生化工程師挖掘和開發(fā)，應用于包涵體蛋白質的折疊復性，解決了多種基因工程蛋白質的制備難題，并將蛋白質折疊復性發(fā)展成為生物化工的一項獨特的單元操作［12-13］。

4 建立協(xié)同創(chuàng)新體系，推動生化工程成果轉化和人才培養(yǎng)

4.1 BPEC是麻省理工學院教授合作創(chuàng)新的平臺

BPEC 能取得成功，與王義翹先生積極倡導的協(xié)同創(chuàng)新精神密切相關。在他的組織下，BPEC 匯聚了MIT 一批杰出科學家，例如：生物醫(yī)學工程專家、血液透析膜理論奠基人Clark K.Colton，代謝工程專家、在合成生物學領域做出重大貢獻的Gregory Stephanopoulos，工業(yè)微生物學先驅、青霉素和頭孢菌素生物合成途徑的發(fā)現(xiàn)者Arnold Demain，蛋白質學專家、NIH MERIT 獎獲得者Jonathan King，分離基因的發(fā)現(xiàn)者、1993年諾貝爾醫(yī)學獎獲得者Philip Sharp 等。雖然他們都有各自的研究方向，但通過BPEC 平臺使他們得以關注生化工程，結合各自的強項，開展協(xié)同創(chuàng)新，使MIT 的生命科學和生物技術研究領先于同行，極大推動了美國生物制藥工程科學的迅猛發(fā)展。

王先生以身作則，積極與BPEC 的教授們合作，例如與電化學專家Alan Grodzinsky 教授合作將電化學方法第一次應用于動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)中［14］，與生物系蛋白質專家Jonathan King 教授合作闡述蛋白質聚集體的形成機制［15］，與代謝工程專家Gregory Stephanopoulos 教授合作研究動物細胞培養(yǎng)過程代謝通路變化的規(guī)律等［16］。

這里介紹一個具體的合作實例。前面提到的蛋白質折疊復性研究取得了重大進展，其中就包括了王先生與BPEC 其他教授的合作。一個典型的例子是對于有二硫鍵蛋白質的體外折疊，采用Cleland 的PEG 保護法難以解決二硫鍵錯配造成的失敗。對此，王義翹先生與膠體化工專家Alan Hatton 教授合作，發(fā)明了一個新的蛋白質折疊過程——反膠團折疊［17］，如圖3所示。

該過程使用化工萃取中的反膠團（reversed micelles）體系裝載變性的蛋白質，讓變性的蛋白質分子通過膠團彼此分離，獨立地重新折疊。這些反膠團是由表面活性劑AOT 穩(wěn)定的水相液滴，懸浮在異辛烷中。通過調整條件，使每個反膠團只裝載一個蛋白質分子，而不會與其他蛋白質發(fā)生作用而產(chǎn)生聚集。以牛胰核糖核酸酶A（RNase A）為模型體系，驗證該創(chuàng)新思維的可行性。結果表明，變性的RNase A可以從含有鹽酸胍的緩沖溶液中轉移到反膠團中（圖3 第1 個箭頭），實現(xiàn)膠團溶液對蛋白質的穩(wěn)定包裹。然后，通過與不含變性劑的水溶液接觸，反膠束中的變性劑濃度降低，變性的蛋白質開始進行自我折疊（圖3 第2 個箭頭），但仍然保留在膠團中。經(jīng)過24 h，反膠團中的蛋白質全部折疊為與天然酶相近的三維結構，加入谷胱甘肽還原和氧化試劑，分子內部重新形成了二硫鍵，恢復了天然的生物活性。此時通過將反膠團與1.0 mol/L KCI 水溶液接觸，恢復了天然生物活性的RNase A就從反膠團進入到水溶液中（圖3第3個箭頭），完成了整個折疊的單元操作。

圖3 反膠團折疊蛋白質的過程設計Fig.3 Process design of protein refolding in a reversed micelle

反膠團折疊變性的蛋白質是BPEC 在生物大分子分離純化工程領域又一個創(chuàng)新。雖然由于蛋白質和蛋白質之間、表面活性劑和蛋白質之間的作用導致折疊過程收率低等原因［2］，這項創(chuàng)新迄今為止還沒有被生物工業(yè)采用，但它基于折疊過程動力學建立的隔離每個蛋白質分子、避免多個蛋白質彼此接觸發(fā)生分子間二硫鍵聚集的巧妙思維一直影響著生化分離科學和技術的研究。

4.2 BPEC 與生物技術企業(yè)的緊密合作促進成果轉化

王義翹先生非常重視與生物技術企業(yè)開展緊密的合作，將這種合作作為BPEC 發(fā)展的特色之一。經(jīng)常有來自生物技術公司如Genentech、Amgen、Biogen、Sepracor、Genzyme 的專家到BPEC 考察并做學術交流。很多BPEC 教授也是這些合作公司的顧問或參與人。例如，王先生本人就是Biogen 公司科學委員會的起始成員（original member），對該公司成功生產(chǎn)復雜生物藥起了重要作用，該公司已成為美國最著名的生物制藥公司之一。BPEC 的生化工程基礎研究也得到各大生物技術公司的認可和積極支持，他們將工業(yè)化遇到的難點和困難進行反饋，BPEC 從中提取關鍵基礎科學問題進行研究，不僅使成果得到了應用，而且使學術探索與生物技術工業(yè)的前沿緊密結合。

我在BPEC 的課題就是一項與工業(yè)部門緊密結合的研究。這項研究是關于親和膜的特性，是膜分離向生物吸附分離的發(fā)展，其創(chuàng)新的思路是在膜表面偶聯(lián)上親和配基，用于選擇性吸附溶液中的生物大分子。這項研究是與Sepracor 公司合作開展的。Sepracor 公司正在投資生產(chǎn)親和膜，希望將這一新技術產(chǎn)品應用到工業(yè)部門，急需解決親和膜相關的科學問題，包括分離機理、控制因素、過程模型和自動化控制等。Colton 教授是我的直接領導者，他獲得了NSF 對這項研究的資助，并且充分信任我，給我配置研究助手，先后有來自德國的研究生Gregor Daun［18］、來自法國的博士后Catherine Charcosset［19］和來自印度并剛剛獲得美國西北大學博士學位的Sujatha Karoor［20］與我一起工作。我還多次到Sepracor 公司，利用那里的設施和條件開展實驗，并與那里的科研人員進行交流。

我們的研究取得了一系列的新發(fā)現(xiàn)和新發(fā)展：以Protein A 作為配基成功實現(xiàn)對稀溶液中單抗的捕捉，吸附效率遠超過親和色譜；第一次考察和表征了中空纖維微孔膜偶聯(lián)Protein A 前后的結構變化和配基分布，采用透過曲線分析法建立吸附模型并用貝塞爾函數(shù)解析了模型的偏微分方程，得到了理論透過曲線［21］。圖4 是我們當時提出的親和膜分離的概念，其原理是微孔膜作為載體的親和吸附，和親和色譜一樣包括進料、淋洗、洗脫和再生。親和膜作為膜分離科學的研究對象，20 多年來已經(jīng)取得了許多重要進展，例如其快速吸附的性能已經(jīng)在生物體液選擇性清除有害物質中獲得了應用［22］。

2.1.1 地徑 地徑是苗木距地面一定距離處的直徑，地徑可以反映牡丹莖桿粗壯狀況[6]。從圖1可以看出，4種立體栽培模式下油用牡丹地徑2016年均高于2015年，其中油用牡丹單一種植模式增長的幅度最高，油用牡丹-核桃套種的次之，油用牡丹-碧桃套種增長幅度最低，這可能與樹種遮陰，光照不足有關。

圖4 親和膜吸附分離蛋白質基本原理和操作Fig.4 Principle and operation of affinity membrane for adsorption separation of proteins

我在BPEC 報告親和膜研究進展時候得到王義翹先生的好評。他提出了幾個很好的建議，例如與親和色譜作比較要注意濃度的選擇，在建立模型的時候要考慮微孔膜的不均勻性，要重視親和膜中膜污染的預防等。他還向Charles Cooney 教授推薦我參加了BPEC 組織的生物技術下游工藝（Downstream Processing）課程的助教工作，使我有機會與擔任授課人的國際知名蛋白質分離純化專家聯(lián)系和交流，并結識了前來聽課的美國生物技術企業(yè)的一些研發(fā)人員，從中學習到很多生物技術工業(yè)生產(chǎn)方面的知識。值得說明的是，下游工藝課程的設立也是王義翹先生加強與生物技術企業(yè)合作的一個舉措，他是該系列課程的策劃人之一，并擔任破碎細胞和蛋白質折疊復性課程的主講。

4.3 BPEC是世界生化工程杰出人才培養(yǎng)的基地

20 世紀80～90 年代是生化工程迅速崛起的時期。王義翹先生創(chuàng)建生物技術過程工程中心，在生物小分子研究的基礎上拓展到生物大分子制藥工程，吸引了大量青年人才到BPEC 攻讀研究生，也吸引了世界各地生化工程學者訪問進修。優(yōu)秀的人才，前沿的課題加上杰出的教授，使BPEC 的學術氛圍異?；钴S，產(chǎn)生的大腦風暴（brain storming）激發(fā)了創(chuàng)新的火花，使得許多科學難題被攻破，一批生化工程人才脫穎而出走向世界［23］。在王先生擔任主任的15年間，BPEC獲得了博士和碩士學位的研究生數(shù)百人，各種時間段的訪問學者近千人。

王先生既是一位著名科學家，也是一位杰出的教育家。在他手下攻讀學位的研究生都盛贊他學術嚴謹，和藹可親，教育有方。他指導的研究生畢業(yè)以后成績斐然，有的在生化工程研究和教學取得了豐碩的成果，如美國明尼蘇達大學的胡維碩（Hu Wei-Shou）教授、加拿大UBC 的James Piret 教授、美國佐治亞理工學院的Andreas Bommarius教授等；有的投身工業(yè)界在科技轉化和產(chǎn)品開發(fā)上做出突出貢獻，如美國博大公司（PerSeptive）的創(chuàng)始人、現(xiàn)Moderna 公司（新冠mRNA 疫苗開發(fā)者）董事、旗艦先驅公司（Flagship Pioneering）總裁Noubar Afeyan，北京神州細胞生物技術集團股份公司董事長兼總經(jīng)理、北京義翹神州科技股份有限公司董事長、北京協(xié)和醫(yī)科大學細胞工程研發(fā)中心主任謝良志等。

王先生不僅對自己的學生認真負責，而且對所有BPEC 的學生和學者都一視同仁，給予親切的關心和指導。一個典型例子是研究生Arun Chandavarkar的論文工作。

Arun 的課題是蛋白質對微孔膜污染的動力學［24］。微孔膜分離經(jīng)常用于從蛋白質溶液中去除細胞和細胞碎片。由于微孔膜的孔道一般為0.1～0.45 μm，細胞和細胞碎片為微米級（1～20 μm），蛋白質分子尺寸是納米級，因此蛋白質將穿過微孔膜。但是在大規(guī)模生產(chǎn)中卻出現(xiàn)蛋白質被微孔膜截留、膜受到嚴重污染的情況。

Arun 的導師是生物過程工程專家Charles Cooney 教授，論文指導小組包括Clark Colton、William Dean、Gregory Stephanopoulos、Martin Yarmush 等國際著名的膜分離、傳質、反應和蛋白質科學專家。他們的高水平指導和Arun 的才智與勤奮結合，獲得了一系列新發(fā)現(xiàn)。如圖5 所示，其中（a）是用蠕動泵將含有牛血清白蛋白的溶液打循環(huán)，然后用0.2μm 的膜過濾不同循環(huán)時間的蛋白質溶液［圖5（b）］。其結果如圖5（c）所示，在沒有經(jīng)過泵循環(huán)時，獲得的濾液和時間接近正比；但是用泵循環(huán)5min 以后再進行膜過濾的時候，就發(fā)現(xiàn)過濾速度迅速下降并產(chǎn)生了膜堵塞。但是Arun 面臨的一個關鍵問題是，堵塞微孔膜的罪魁禍首到底是什么，怎樣去發(fā)現(xiàn)與表征？

圖5 不含細胞的純蛋白質溶液通過微孔膜產(chǎn)生的過濾速度下降Fig.5 Flux decline of cell-free protein solution through a microporous membrane

王義翹先生雖然不是Arun 的導師，也不是論文指導小組的成員，但他幾乎每次都參加BPEC 的午飯討論會（BPEC 內部的一種學術交流），熟悉每個研究組的進展并給予學術指導。對于Arun 面臨的難題，王先生推斷在泵輸送蛋白質溶液的過程中有超大的蛋白質聚集體產(chǎn)生，堵塞了膜孔道，是造成flux下降的罪魁禍首。王先生建議采用準彈性光散射（quasi-elastic light scattering，QLS）方法來測定溶液中蛋白質聚集體的形成，再結合還原型和非還原型電泳分析來確定聚集體生成的動力學。這個建議很有創(chuàng)意，因為如果單純采用傳統(tǒng)的電泳分析，只能確定白蛋白的二聚體或三聚體，但很難確定多聚體的存在。超速離心或蛋白質色譜可以證明聚集體存在，但在分析過程中容易造成聚集體的破壞。而QLS 采用激光技術，不會造成聚集體的裂解，可以很快計算出溶液中出現(xiàn)的蛋白質聚集體的尺寸和數(shù)量，是一種先進、快速和相對準確的方法。

在王先生的支持下，Arun 掌握了QLS 技術，將其應用于微孔膜堵塞機理的研究，終于獲得突破。他發(fā)現(xiàn)不同的泵送系統(tǒng)和不同的膜分離模式對形成蛋白質聚集體影響非常大。工業(yè)部門常用的泵送系統(tǒng)容易使蛋白質溶液產(chǎn)生聚集體，泵送的次數(shù)越多、時間越長，溶液中的聚集體數(shù)量就越多。由于聚集體的本質是一種無規(guī)則的絮凝體，尺寸不僅大于微孔膜的孔道，而且由于其膠體的特性極易堵塞孔道并在膜表面形成濃度極化層。盡管形成的蛋白質絮凝體還不到全部蛋白質的5‰，但卻足以使膜過濾通量迅速下降。此外，失活的蛋白質等于增加了雜質的含量，給質量控制帶來了麻煩。通過合理設計膜分離過程的設備、流程和操作模式，不僅可以避免膜分離過程中的污染現(xiàn)象，提高生產(chǎn)的效率，而且可以避免或減少蛋白質絮凝體的形成，確保產(chǎn)品的質量和安全性。

Arun的研究結果得到了答辯委員會專家的肯定和好評，獲得了博士學位。由于BPEC 與美國生物技術工業(yè)的緊密聯(lián)系，他的研究結果也得到了各大生物制藥公司的重視。這些公司的研究團隊迅速采取相應的技術措施，改進膜分離過程的工藝設計，解決了以往效率低的技術瓶頸，減少了蛋白質溶液的失活，提升了過程的經(jīng)濟性和安全性。Arun在博士論文的致謝中寫到：Professor Daniel Wang，although not on my thesis committee，was a great source of inspiration with his many thought provoking questions during the weekly group seminars［24］。

可以說，卓越的人才培養(yǎng)業(yè)績是王義翹先生生平的另一座豐碑，其高度和創(chuàng)建BPEC 一樣。因此MIT 在訃告中用了這樣的副標題：Longtime MIT professor launched the Biotechnology Process Engineering Center and influenced generations of students［1］。

5 對我國生物過程科學技術發(fā)展的影響和啟示

我國生物技術在20世紀80年代起步。國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）將生物技術作為重點，推動了國際交流合作，90年代赴美訪問留學人數(shù)迅速增加。BPEC 作為美國國家基金會資助的生物過程科技研發(fā)的重點單位，吸引了很多中國學者的注意。筆者在BPEC 期間曾幫助聯(lián)系我國生物代表團和一些個人的參觀和訪問，得到王義翹先生的大力支持。盡管工作非常繁忙，他總是抽出時間來接待我國來訪者，介紹BPEC 的發(fā)展經(jīng)驗和成果，回答客人感興趣的問題，了解和傾聽我國生物技術的進展，推薦MIT的相關教授和美國生物技術研究的重點大學、研究所和公司等，使來訪者受益匪淺。從90年代開始，在BPEC從事研究的中國訪問學生和研究生逐漸增加，他們中多數(shù)人學成之后回國效力，成為我國生物技術發(fā)展的中堅力量。

BPEC 的成功經(jīng)驗為我國生物技術的發(fā)展起到了重要的參考和借鑒作用。由于麻省理工學院是美國大學化學工程教育和科研的發(fā)源地，我國化工界歷來重視他們的科研動向。生化工程在國際上的興起，MIT 得到NSF 的資助建立了BPEC，促進了我國化工領域科學研究向生化工程傾斜。各大化工院校和科研院所都對生化工程進行了布局。20 世紀80 年代，中國科學院化工冶金研究所（現(xiàn)過程工程研究所）所長、國際著名化工專家郭慕孫先生聯(lián)合上海細胞生物學研究所著名細胞生物學家施履吉先生向中科院、國家科委和國家計委提出建立生化工程國家重點實驗室的建議；同期，華東化工學院（現(xiàn)華東理工大學）我國生化工程先驅者俞俊棠教授向國家教委、國家科委和國家計委提出建立生物反應器工程重點實驗室的建議。這兩項建議在1988 年得到批準，國家計委將“生化工程國家重點實驗室”和“生物反應器工程國家重點實驗室”列入全國國家重點實驗室建設的名單。各個重點高校化工學院也相繼建立了生化工程（現(xiàn)生物工程）專業(yè)，一批省部級重點實驗室如生物工程、工業(yè)生物催化、系統(tǒng)生物工程等獲得了中科院、教育部和地方政府的支持。這些重點實驗室在建立和發(fā)展中，都非常重視汲取同行成功的經(jīng)驗，BPEC 作為國際領先的科研單位無疑是重點學習的對象，而我國的重點實驗室在學習同行的同時，也突出了國家需求和與時俱進，強調了工程科學的創(chuàng)新。

生化工程國家重點實驗室的建設和發(fā)展具有一定的代表意義。老一輩科學家積極推動生化工程的建設，申請到了國家重點實驗室，但如何開展創(chuàng)新研究，卻需要后繼者進行努力。生化工程國家重點實驗室和BPEC 的定位相同，都是側重于過程工程（process engineering），從基礎到應用，從原料到產(chǎn)品，解決生物技術產(chǎn)業(yè)化的工藝、技術、裝備、質量和經(jīng)濟性等關鍵科學問題。但在研究的大方向上，生化工程國家重點實驗室除了生化反應工程和生化分離工程外，還包括了生化制劑工程。如圖6所示，生化反應工程、生化分離工程和生化制劑工程是一個接力型的整體，包括了從原料到產(chǎn)品的整個過程。BPEC 在布局上沒有考慮制劑工程，可能是由于當時MIT 化工系還有Robert Langer領導的專門從事各種緩釋、控釋技術的實驗室，已經(jīng)在國際上處于領先地位。對于我國來講，制劑工程非常急需，而且與反應工程和分離工程相互連接。重點實驗室將生化制劑工程作為主要方向之一，反映了國際前沿和國家需求，也便于向同行學習和提升。事實證明，這個研究方向的布局非常正確，已經(jīng)取得了突飛猛進的發(fā)展［25-26］。

圖6 生化工程國家重點實驗室科研方向的結構Fig.6 Structure of research directions for State Key Laboratory of Biochemical Engineering

生化工程國家重點實驗室學習了BPEC 與時俱進、與生物技術前沿緊密結合的思想。實驗室在成立初期，研究的重點是生物反應器和生物質工程。隨著我國生物技術的迅猛發(fā)展和需求，實驗室又將研究重點拓展到生物制藥領域。與以往的小分子產(chǎn)物不同，生物制藥的主要目標產(chǎn)物是有復雜空間結構的超大分子，如血液蛋白質、細胞因子、抗體、疫苗。對于化工背景的科研單位和研究人員來說，這方面研究基礎薄弱。而當時很多生物學專家對于生化工程能起到的作用還不清楚。面對挑戰(zhàn)，實驗室緊緊抓住生物制藥中規(guī)模、質量、安全性和成本等涉及工程科學的關鍵問題，充分發(fā)揮膜分離、色譜分離和修飾反應的優(yōu)勢，在血液代用品、長效細胞因子藥物、基因工程疫苗的分離純化、聚乙二醇化、質量控制和規(guī)模化制備上做出了突出的貢獻，成功實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，獲得了各種獎勵，并得到了生物領域專家的認可，促進了交流合作和科研成果從實驗室到產(chǎn)業(yè)化鏈條的建立。

6 結語

本文從作者自己的視角，通過對歷史的回顧和BPEC 的科研實例，反映王義翹先生及其創(chuàng)立和領導的麻省理工學院生物技術過程工程中心的重大貢獻。其中涉及的科研內容對今天的研究仍有參考價值。王義翹的深邃遠見，將生化工程拓展到生物制藥領域，率先開展了動物細胞培養(yǎng)工程和蛋白質分離純化工程，為生物技術的發(fā)展起到了重大的支撐作用；他將眾多教授匯聚在BPEC 這一國家級科研平臺上，學科交叉，知識融合，取得了眾多協(xié)同創(chuàng)新的優(yōu)秀成果；他開展與企業(yè)的合作，從大規(guī)模生產(chǎn)難題中提煉科學問題，再通過基礎與應用結合的創(chuàng)新，突破了許多制約產(chǎn)業(yè)化的技術瓶頸，確立了生化工程在生物技術中不可替代的地位；他重視人才培養(yǎng)，建立學術交流機制，激發(fā)年輕一代的聰明才智，為生化工程的可持續(xù)發(fā)展做出了巨大貢獻。

回顧王義翹先生和他領導BPEC 對我國生化工程的影響，印象最為深刻的是與時俱進的創(chuàng)新精神。這種精神體現(xiàn)在建立了生化工程在我國生命科學和生物技術發(fā)展中獨特的學術地位和領域，從生物反應器到生物催化，從生物分離純化到生物藥長效化和靶向化，從裝備、介質、工藝到生物生產(chǎn)的管道化和智能化，成為生命科學和生物技術可持續(xù)發(fā)展的支撐。不僅如此，我國生化工程研究者也已融合到合成生物學、基因編輯學、疫苗合成學等前沿生命科學研究的大軍中，正在發(fā)揮著越來越重要的作用。