黃海堂 吳輝坤 皇甫炎林 潘 誼

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué) (湖北 武漢， 430061) 2.湖北省中醫(yī)藥研究院，湖北省中醫(yī)院

湖北省中醫(yī)院肝病研究所在20余年的臨床實(shí)踐與科學(xué)研究中，形成了獨(dú)特的肝癌治療思路，即從“毒痰瘀虛”四大證候要素進(jìn)行臨床辨證論治。前期研究表明，根據(jù)肝癌“毒痰瘀虛”的證候要素特點(diǎn)，采用扶正解毒化痰祛瘀法治療肝癌患者可有效改善癥狀，具有明顯的臨床效果。通過(guò)對(duì)前期肝病門(mén)診原發(fā)性肝癌患者的處方藥物進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘[1]，綜合吳壽善等全國(guó)名老中醫(yī)治療肝癌的用藥特點(diǎn)，課題組總結(jié)出了治療肝癌的31味高頻中藥。本課題對(duì)此31味中藥進(jìn)行了CCK-8篩選，初步形成了針對(duì)證候要素“毒、痰、瘀、虛”的中藥復(fù)方毒痰瘀脾腎虛方，即毒痰瘀全方。為了闡明肝癌毒痰瘀虛四大證候要素的科學(xué)性及其本質(zhì)，我們根據(jù)毒痰瘀脾腎虛方組方的證候要素特點(diǎn)進(jìn)行拆方、組方，分別形成了全方、脾虛方、腎虛方、腎陽(yáng)虛方、腎陰虛方，毒痰瘀方6大組方，并通過(guò)小鼠試驗(yàn)，探討中藥復(fù)方及其拆方組方對(duì)肝癌荷瘤小鼠瘤體的影響，比較全方與拆方組方間的作用差異，分析基于毒痰瘀虛理論的中藥復(fù)方抗肝癌的作用效果與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞 雄性昆明小鼠40只，體重 (20±2)g，購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；H22肝癌細(xì)胞株購(gòu)至武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 藥物組成 毒痰瘀方：葉下珠、旋覆花、皂角刺各10 g，半枝蓮、白花蛇舌草各15 g，天葵子、丹參、姜黃各20 g，黨參30 g。腎虛方：毒痰瘀方加干地黃、續(xù)斷、沙苑子各20 g。腎陽(yáng)虛方：毒痰瘀方加續(xù)斷、沙苑子各20 g。腎陰虛方：毒痰瘀方加干地黃20 g。脾虛方：毒痰瘀方加炙黃芪、白術(shù)各30 g。全方：毒痰瘀方加炙黃芪、白術(shù)各30 g，干地黃、續(xù)斷、沙苑子各20 g。索拉非尼(200 mg/粒)購(gòu)自德國(guó)拜耳制藥公司。

1.3 制劑方法 所用中藥購(gòu)自我院藥劑科，由我院藥劑科分別加工成生藥含量為 2 g/ml 的復(fù)方藥劑。計(jì)算藥物總克數(shù)，加10倍蒸餾水，倒入鍋中煎煮1 h后用紗布過(guò)濾出濾液待用；藥渣加10倍蒸餾水再煎1次，過(guò)濾；丟掉藥渣，把兩次得到的濾液倒入鍋內(nèi)加熱濃縮，使藥液濃度濃縮至2 g/ml，裝瓶，放入冰箱備用。濃度計(jì)算方法:濃度=復(fù)方總克數(shù)(g)/濃縮液體積(ml)。

1.4 試驗(yàn)器材 脫水機(jī)、組織攤烤片機(jī)購(gòu)于武漢俊杰公司，病理切片機(jī)購(gòu)于德國(guó)Leica RM公司，載玻片及蓋玻片購(gòu)于江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司，抗原修復(fù)用電陶爐購(gòu)于SKG，BX53型生物顯微鏡購(gòu)于奧林巴斯，微量移液器購(gòu)于Eppendorf，電泳儀電源、垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)儀購(gòu)自北京六一儀器廠，水平搖床購(gòu)自江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司，pH計(jì)購(gòu)自德國(guó)Metter-Toledo GmbH公司，磁力攪拌器購(gòu)自金壇市中大儀器廠，酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo，離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.5 主要試劑 無(wú)水乙醇、二甲苯、鹽酸、包埋石蠟、中性樹(shù)膠購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)，蘇木素購(gòu)于Sigma，Dako REAL EnVision Detection System購(gòu)于安捷倫(Dako)，磷酸酶抑制劑、PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天，TEMED、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺購(gòu)自Amresco，Trise-Base、二硫叔糖醇(DTT)、Trise-Base、Tris-base購(gòu)自Biosharp，蛋白marker(10-250 KD)購(gòu)自fermentas，小鼠單抗β-actin 、HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，兔多抗p-GSK3β(46 KD)購(gòu)自AFFINITY，余檢測(cè)抗體均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，X光膠片購(gòu)自柯達(dá)，顯影定影試劑盒購(gòu)自天津市漢中攝影材料廠，WB檢測(cè)其他化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.6 方法

1.6.1 動(dòng)物分組 雄性昆明小鼠40只隨機(jī)分為8組，A組為空白組，B組為索拉菲尼組，C組為全方組，D組為脾虛組，E組為腎虛組，F(xiàn)組為腎陽(yáng)虛組，G組為腎陰虛組，H組為毒痰瘀組，每組5只小鼠。

1.6.2 造模與處理 ①常規(guī)方法復(fù)蘇小鼠H22肝癌細(xì)胞,在1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3 d；②用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為(2～3)×106個(gè)/ml,取0.2 ml注入小鼠腹腔內(nèi),待 7～10 d后,抽取腹水，按上述方法進(jìn)行傳代2次；③無(wú)菌操作取上述H22小鼠腹水,用無(wú)菌生理鹽水稀釋,臺(tái)盼藍(lán)染色瘤細(xì)胞計(jì)數(shù),活瘤細(xì)胞>90%,調(diào)整瘤細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml,取0.2 ml接種到小鼠右腋皮下。④待小鼠普遍出瘤至直徑約1 cm時(shí)開(kāi)始灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥2周。A組小鼠不給于任何藥物，B組小鼠給予索拉非尼4 μmol/g灌胃，C、D、E、F、G、H各組小鼠按照2 ml/100 g 體重給予相應(yīng)的中藥濃縮液灌胃。均以標(biāo)準(zhǔn)飼料和正常飲水進(jìn)行喂養(yǎng)。自給藥開(kāi)始之日起，在第20 d時(shí)使用頸椎脫臼法處死所有小鼠，分離腫瘤組織，稱(chēng)重，計(jì)算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率(%)=(空白組平均瘤重-藥物組平均瘤重)/空白組平均瘤重×100%。

1.6.3 免疫組化法分析瘤體微血管密度及Western blot檢測(cè) 腫瘤組織中p-GSK3β、β-catenin蛋白表達(dá)。按照常規(guī)方法操作。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠抑瘤率比較 見(jiàn)表1。

表1 不同藥物對(duì)小鼠瘤體抑瘤率比較

2.2 不同藥物處理對(duì)瘤體微血管密度的影響 見(jiàn)表2。

表2 不同藥物處理對(duì)MVD的影響

2.3 各組小鼠腫瘤組織中p-GSK3β、β-catenin蛋白的表達(dá) 見(jiàn)圖1、2。

圖1 不同組瘤體組織中p-GSK3β、β-catenin蛋白的表達(dá)

圖2 不同組瘤體組織中p-GSK3β、β-catenin蛋白的表達(dá)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，毒痰瘀全方及其拆方組方皆可顯著抑制小鼠瘤體的生長(zhǎng)，降低腫瘤組織MVD表達(dá)，抑制肝癌組織中血管的生成。微血管形成是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移能力提高的主要原因，在腫瘤的惡性生物學(xué)行為中起到至關(guān)重要的作用，而MVD是反映血管形成的關(guān)鍵指標(biāo)[2]。毒痰瘀全方及脾虛方、腎虛方、腎陽(yáng)虛方、腎陰虛方在毒痰瘀方的基礎(chǔ)上按其不同證候分型加入了黃芪、白術(shù)、干地黃、續(xù)斷、沙苑子補(bǔ)脾益腎藥物，對(duì)MVD的抑制效果皆明顯優(yōu)于毒痰瘀方。研究發(fā)現(xiàn)[3]，黃芪低分子量多糖無(wú)法直接殺傷癌細(xì)胞，通過(guò)刺激機(jī)體免疫，提高淋巴細(xì)胞增殖率等，增強(qiáng)機(jī)體的各項(xiàng)免疫能力，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤的作用；沙苑子具有一定程度的抗癌、抗突變及提高機(jī)體特異性免疫與非特異性免疫功能[4]。臨床研究中，白術(shù)多糖作為白術(shù)的主要成分，對(duì)小鼠具有良好的免疫增強(qiáng)作用，可有效促進(jìn)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化功能，有效降低腫瘤細(xì)胞增殖率[5]，干地黃、續(xù)斷在增強(qiáng)機(jī)體免疫方面亦具有較好的效果[6，7]。免疫過(guò)程在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的抑制作用，由此我們推測(cè)黃芪、白術(shù)、干地黃、續(xù)斷、沙苑子在抗腫瘤功效方面可能與解毒、化痰、祛瘀類(lèi)藥物發(fā)揮著協(xié)同作用。

由Western blot檢測(cè)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，全方及其拆方組方皆可明顯抑制β-catenin蛋白的表達(dá)。全方對(duì)蛋白抑制效果接近索拉菲尼，優(yōu)于其拆方組方，而毒痰瘀方劣于全方及其他拆方組方。全方對(duì)β-catenin蛋白的抑制作用與毒痰瘀腎虛方無(wú)明顯差異，皆?xún)?yōu)于其他拆方組方。糖原合酶激酶3β(GSK3β)是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，有高達(dá)上百種的底物并為多條信號(hào)通路樞紐，在細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮著非常重要的功能，與細(xì)胞分裂和凋亡、糖原代謝、生長(zhǎng)代謝、神經(jīng)信號(hào)傳遞、腫瘤發(fā)生等均密切相關(guān)。GSK3β作為Akt的底物，能夠被Akt直接磷酸化而失活，引起轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而發(fā)揮促細(xì)胞生存和抗凋亡等作用[8，9]。β-catenin是典型Wnt信號(hào)通路的核心成分，其核積累是Wnt信號(hào)靶基因轉(zhuǎn)錄激活所必需的，β-catenin蛋白可以調(diào)節(jié)Wnt下游幾個(gè)靶基因的轉(zhuǎn)錄，如cyclinD1、cmyc等，促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[10]。β-catenin在人肝癌腫瘤標(biāo)本和肝癌干細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)，并導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后不良[11]。

綜上所述，基于毒痰瘀脾腎虛方及其拆方組方皆可明顯抑制肝癌小鼠瘤體及微血管的生長(zhǎng)，降低β-catenin蛋白的表達(dá)，具有較好的抗腫瘤作用，全方效果較好，其不同拆方在抗癌療效方面有所側(cè)重，但作為整方的有機(jī)組成從不同環(huán)節(jié)發(fā)揮了協(xié)同作用，其機(jī)制尚待深入研究。