徐 俊 戚 璐 周 濤 胡 聰 郭 晟 張 凡 程良斌

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 (湖北 武漢， 430061) 2.宜昌市第二人民醫(yī)院 3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院 4.湖北省中醫(yī)院肝病科

慢性乙型肝炎(CHB)肝纖維化是CHB發(fā)展為肝硬化、肝癌的一種可逆轉(zhuǎn)性病理過程，對CHB患者給予及時(shí)合理的診療是降低肝硬化和肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的有效途徑之一[1]。中華醫(yī)學(xué)會頒布《肝纖維化診斷及治療共識(2019版)》指出[2]，目前尚無有效和公認(rèn)地抗肝纖維化的化學(xué)藥物或生物制劑，中醫(yī)藥在抗肝纖維化治療方面有著獨(dú)特的功效?？估w軟肝顆粒(KXRG)為湖北省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，前期研究表明，KXRG聯(lián)合恩替卡韋(ETV)抗乙型肝炎肝纖維化臨床療效優(yōu)于單純ETV[3]。近年來腸道菌群失調(diào)與其介導(dǎo)的炎癥與免疫反應(yīng)被證實(shí)促進(jìn)乙型肝炎肝纖維化的形成[4，5]，同時(shí)中藥復(fù)方對腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)調(diào)控正受到廣泛關(guān)注[6]?；诖?，筆者通過回顧性對照研究方法，探究KXRG對乙型肝炎肝纖維化患者腸道菌群的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象為2018年6月至2019年10月期間就診于我院的CHB肝纖維化確診患者，依據(jù)電子病歷系統(tǒng)，收集患者臨床資料根據(jù)所服藥物的不同分為對照組和治療組。治療組患者44例，男20例，女24例；平均年齡(44.8±9.2)歲；平均病程(4.9±1.6)年。對照組患者36例，男16例，女20例；平均年齡(45.2±8.7)歲；平均病程(5.1±1.3)年。兩組患者在性別、年齡、病情、病程方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《慢性乙型肝炎防治指南》(2019版)CHB肝纖維化診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]；②年齡18～65歲；③接受治療初始以及治療6個月后資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他原因?qū)е碌母卫w維化者(如酒精、藥物及自身免疫性肝炎等)；②資料不完整或中斷服藥者；③出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥如肝衰竭、肝性腦病，消化道出血及原發(fā)性肝癌者；④合并有嚴(yán)重的原發(fā)性疾病，如心腦血管、肺、腎、內(nèi)分泌、造血系統(tǒng)嚴(yán)重疾病、腫瘤等；⑤服用其他藥物出現(xiàn)不良影響的患者；⑥妊娠或精神疾病者。

1.3 治療方法及觀察指標(biāo) 治療方法：對照組患者口服恩替卡韋(正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20100019)0.5 mg/次，1次/d。治療組患者在對照組基礎(chǔ)上，聯(lián)用中藥KXRG(湖北省中醫(yī)院藥劑科，鄂20160091HZQ)10 g/次，3次/d。療程均為6個月。觀察指標(biāo)：①瞬時(shí)彈性成像(TE)技術(shù)檢測肝臟硬度值；②16S rRNA測序技術(shù)檢測腸道菌群，并進(jìn)行生物信息分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者肝臟硬度值檢測情況 見表1。

表1 兩組患者肝臟硬度值比較

2.2 兩組患者腸道菌群檢測情況

2.2.1 OTU分類 對兩組患者的OTU聚類結(jié)果進(jìn)行分析比較，治療組患者有OTU 3 425個，對照組患者有OTU 2 749個。兩組患者相同的OTU為2 320個，治療組患者特有OTU 1 105個，對照組患者特有OTU 429個。對兩組患者每個樣本OTU進(jìn)行分析比較，治療組患者OTU顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患者腸道菌群OTU比較

2.2.2 Alpha多樣性分析 見表3。

表3 兩組患者腸道菌群Alpha多樣性分析指數(shù)比較

2.2.3 Beta多樣性分析 兩組患者樣本在2D和3D圖中均遠(yuǎn)離彼此，具有明顯的各自區(qū)域，樣本差異明顯，見圖1A、B。

圖1 Beta多樣性分析

2.2.4 不同水平上物種結(jié)構(gòu)與差異 在門水平上，兩組患者標(biāo)本排名前10的分別是擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門、放線菌門、藍(lán)細(xì)菌門、疣微菌門、Epsilonbacteraeota、河床菌門、硝化螺菌門，其中擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門占比90%以上，與對照組相比，治療組患者擬桿菌門豐度上升，變形菌門豐度、梭桿菌門豐度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、3。在科水平上，兩組患者標(biāo)本排名前10的分別是擬桿菌科、腸桿菌科、梭桿菌科、鏈球菌科、韋榮球菌科、毛螺菌科、瘤胃菌科、丹毒絲菌科、普雷沃氏菌科、雙歧桿菌科，與對照組相比，治療組患者擬桿菌科、毛螺菌科豐度上升；腸桿菌科、梭桿菌科、韋榮球菌科、鏈球菌科豐度下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4、5。

圖2 門水平的菌群結(jié)構(gòu)圖

圖3 門水平具有顯著差異的菌群

圖4 科水平的菌群結(jié)構(gòu)圖

在屬水平上，兩組患者標(biāo)本排名前10的分別是擬桿菌屬、棲糞桿菌屬、普雷沃氏菌屬、羅氏菌屬、梭桿菌屬、毛螺菌屬、瘤胃球菌屬、埃希菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬。與對照組相比，治療組患者擬桿菌屬、毛螺桿菌屬、雙歧桿菌屬豐度上升，埃希菌屬、韋榮球菌屬、梭桿菌屬豐度下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6、7。

圖5 科水平具有顯著差異的菌群

圖6 屬水平的菌群結(jié)構(gòu)圖

圖7 屬水平具有顯著差異的菌群

3 討論

此次回顧性臨床研究結(jié)果顯示，對于CHB肝纖維化患者，在ETV治療的基礎(chǔ)上，聯(lián)用KXRG可增強(qiáng)其臨床療效、有效改善患者肝臟硬度值，這驗(yàn)證了此前的研究成果[3]，證實(shí)了KXRG的抗肝纖維化作用。

此次研究立足腸道菌群，使用16S rRNA測序技術(shù)對兩組患者糞便樣本進(jìn)行檢測。OTU是微生物研究中的一個分類操作單元，根據(jù)不同的相似度水平，研究者將對所有序列進(jìn)行OTU劃分，認(rèn)為相似性大于97%代表一個物種[7]。Alpha多樣性分析又稱樣本復(fù)雜度分析，用于對單個樣本中的物種多樣性進(jìn)行評估，主要評估指標(biāo)包括Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)，指數(shù)與樣本多樣性呈正相關(guān)[8]。Beta多樣性分析是比較不同分組樣本的差異，這些差異比較常基于OTU序列相似性和群落的結(jié)構(gòu)(即物種豐度及分布)，或者同時(shí)考慮OTU序列的進(jìn)化關(guān)系以及群落結(jié)構(gòu)。PCoA分析是Beta多樣性分析中一種代表性的基于多種距離矩陣的分析結(jié)果[9]，通過PCoA可以觀察個體或群體間的差異，圖中每個點(diǎn)代表一個樣本，相同顏色為相同分組，同一組的樣本距離越近，并與其他組有明顯距離，說明分組效果好。在本次研究中，與對照組相比，治療組患者腸道菌群OTU數(shù)量增加，Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)顯著升高；分析顯示兩組樣本有明顯界限。對菌群改變在各個水平的分布情況顯示，門水平上，擬桿菌門豐度升高，變形菌門、梭桿菌門豐度降低；科水平上，擬桿菌科、毛螺菌科豐度升高，腸桿菌科、梭桿菌科、韋榮氏菌科、鏈球菌科豐度降低；屬水平上，擬桿菌屬、毛螺菌屬、雙歧桿菌屬豐度升高，埃希菌屬、韋榮球菌屬、梭桿菌屬豐度降低。

腸道微環(huán)境是一個小型的生態(tài)系統(tǒng)，而菌群的多樣性是衡量這一微生態(tài)系統(tǒng)平衡與否的重要指標(biāo)之一[10]。健康狀態(tài)下，腸道菌群生態(tài)結(jié)構(gòu)是由各種益生菌、有害菌、中立菌均衡組建，相互制約[11]，而在某些病理狀態(tài)下，腸道生態(tài)發(fā)生變化[12]，其中一部分“生存者”被消滅，而剩下的“幸存者”在適應(yīng)環(huán)境后，往往過度生長，機(jī)體的腸道微生態(tài)多樣性發(fā)生下降。鄭瑞鵬[13]研究表明，肝纖維患者腸道菌群多樣性指數(shù)如Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)較正常人顯著降低。在本次研究中，KXRG的干預(yù)使得患者腸道菌群多樣性下降這一情況發(fā)生逆轉(zhuǎn)。在肝硬化患者的腸道微生物門系具有更高豐度的變形菌門和梭桿菌門[14]，Shin等[15]研究證實(shí)，變形菌門與炎癥有關(guān)，與肝纖維化發(fā)病和肝硬化風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。Xu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，毛螺菌科細(xì)菌比例與肝功能Child-Pugh評分呈負(fù)相關(guān)，其豐度隨Child-Pugh評分升高而下降。同時(shí)，毛螺菌科細(xì)菌可能參與腸道碳水化合物發(fā)酵分解成短鏈脂肪酸(SCFAs)[17]，而SCFAs調(diào)節(jié)腸道pH的功能，SCFAs產(chǎn)生減少可能會導(dǎo)致結(jié)腸pH值增高，從而引起腸道氨的產(chǎn)生和吸收增加，進(jìn)而誘發(fā)肝性腦病發(fā)生[18]。KXRG可上調(diào)CHB肝纖維化患者腸道的毛螺菌科豐度。鏈球菌和韋榮球菌常存在于人體上消化道黏膜[19]，而肝纖維化患者由于膽汁酸分泌不足，腸道蠕動減緩等因素，容易發(fā)生小腸菌群過度生長和易位[20]，導(dǎo)致腸道內(nèi)鏈球菌和韋榮球菌豐度升高。在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)KXRG下調(diào)腸道內(nèi)鏈球菌科和韋榮球菌科豐度，KXRG可能改善了肝纖維化患者體內(nèi)的小腸菌群過度生長及菌群易位。雙歧桿菌是一種重要的腸道有益微生物。有研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量明顯低于正常人[21]。與Child A級患者相比，Child C級患者腸道雙歧桿菌數(shù)量更低，而KXRG能夠升高患者雙歧桿菌屬的豐度。結(jié)果提示KXRG可有效提升患者腸道內(nèi)部分益生菌豐度，同時(shí)下調(diào)部分致病菌豐度。綜上所述，KXRG可有效改善肝纖維化患者肝硬度值，同時(shí)對腸道菌群具有一定調(diào)節(jié)作用。