陽飛良 劉翔 丁 彭瓊

(萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院普外科，江西 萍鄉(xiāng) 337000)

結(jié)腸癌屬于消化系統(tǒng)腫瘤中常見惡性腫瘤之一，由于結(jié)腸癌早期癥狀不明顯導(dǎo)致患者治療效果較差，但結(jié)腸癌致病機(jī)制尚未完全闡明〔1，2〕。血清腫瘤標(biāo)志物具有高效、簡便、無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，因而基于結(jié)腸癌的分子機(jī)制探尋結(jié)腸癌早期診斷及預(yù)后的分子標(biāo)志物具有重要意義。人軟骨糖蛋白(YKL)-40在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平顯著升高，其高表達(dá)量可能與結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)〔3〕。細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平明顯升高，其高表達(dá)量與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征有關(guān)〔4〕。核糖體S6蛋白激酶(RSK)4蛋白在結(jié)直腸癌組織中陽性表達(dá)率顯著降低，并可能發(fā)揮抑癌基因作用〔5〕。但YKL-40、RSK4、cyclinD1在結(jié)腸癌患者血清中的表達(dá)水平及其與患者預(yù)后的相關(guān)性研究相對較少。本研究通過觀察結(jié)腸癌患者血清及癌組織中YKL-40、RSK4、cyclinD1表達(dá)水平并分析其相關(guān)性，分析其表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，進(jìn)一步探討其對結(jié)腸癌的診斷價(jià)值，為結(jié)腸癌的早期診斷、治療及預(yù)后評估提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年3月至2016年3月于萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院進(jìn)行治療的86例結(jié)腸癌患者為研究對象，所有患者經(jīng)病理證實(shí)為結(jié)腸癌，男56例，女30例，平均年齡(60.12±7.32)歲。收集所有患者臨床病理參數(shù)，35例無轉(zhuǎn)移，51例有轉(zhuǎn)移；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期35例，Ⅲ～Ⅳ期51例；分化程度：高分化26例，中分化21例，低分化39例；左半結(jié)腸43例，右半結(jié)腸43例。同時選取于萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院健康體檢志愿者56例為對照組，男36例，女20例，平均年齡(62.11±6.09)歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有結(jié)腸癌患者于術(shù)中切取結(jié)腸癌組織及其相應(yīng)癌旁組織(≥5 cm)，術(shù)后置于-80℃超低溫冰箱保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)腸癌患者均經(jīng)過手術(shù)病理證實(shí)；術(shù)前未接受放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；心、肝等重要器官嚴(yán)重?fù)p傷；生存期不超過6個月；臨床資料不完整者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者知情且簽署同意書。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器 兔抗人YKL-40、RSK4、cyclinD1單克隆單抗購自美國Sigma公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG購自于美國R&D公司；YKL-40、RSK4、cyclinD1引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；RNA提取試劑盒購自北京生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)試劑盒購自美國Thermo scientific公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自北京索萊寶科技有限公司；免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。BX51光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；ABI 7500型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2.2qRT-PCR檢測結(jié)腸癌患者血清中YKL-40、RSK4、cyclinD1 mRNA表達(dá)水平 所有患者術(shù)前2 d抽取空腹靜脈血3 ml置于不含抗凝劑的試管內(nèi)，4℃條件下經(jīng)3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，吸取上清液，置于4℃冰箱內(nèi)保存待測。采用Trizol法從血清中提取RNA，核酸測定儀測定RNA含量，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。YKL-40引物序列為：上游：5'-GAGGATGGAACTTTGGGTCTC-3'，下游：5'-TCATTTCCTTGATTAGGGTGGT-3'；RSK4引物序列為：上游：5'-AATGCTACCATTCGCTCCTCA-3'，下游：5'-TTACAGGCCAGTTGATGTTCGC-3'；cyclinD1 引物序列為：上游：5'-AGGAACAGAAGTGCGAGGAGG-3'，下游：5'-GGATGGAGTTGTCGGTGTAGATG-3'；β-actin引物序列為上游：5'-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3'，下游：5'-CAAACATGATCTGGGTCATCTCCTC-3'。qRT-PCR反應(yīng)體系共20 μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各0.8 μl，ROX Reference Dye(50×)0.4 μl，ddH2O 6 μl；反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性3 min；95℃ 30 s、60℃ 20 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。YKL-40、RSK4、cyclinD1均以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算YKL-40、RSK4、cyclinD1 mRNA表達(dá)水平。

1.2.3免疫組化染色檢測結(jié)腸癌組織中YKL-40、RSK4、cyclinD1陽性表達(dá)率 制備結(jié)腸癌組織石蠟切片，經(jīng)不同濃度乙醇脫水，置于檸檬酸鹽溶液內(nèi)，20 min后采用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，滴加3%過氧化氫溶液，室溫孵育25 min，PBS清洗，滴加山羊血清(15 min)，加入YKL-40、RSK4、cyclinD1一抗，4℃孵育24 h，PBS清洗，加入二抗，室溫孵育2 h，PBS清洗，滴加DAB顯色液，蘇木素復(fù)染，經(jīng)不同濃度乙醇脫水，加入二甲苯，中性樹脂封片，置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。結(jié)果判定〔6〕：200倍顯微鏡下觀察陽性染色細(xì)胞計(jì)算陽性細(xì)胞百分比，根據(jù)染色程度：未著色計(jì)為0分；淺黃色計(jì)為1分；棕黃色計(jì)為2分；棕褐色計(jì)為3分。按照陽性細(xì)胞數(shù)目：陽性細(xì)胞數(shù)目<10%計(jì)為0分；陽性細(xì)胞數(shù)目10%～30%計(jì)為1分；陽性細(xì)胞數(shù)目31%～60%計(jì)為2分；陽性細(xì)胞數(shù)目>60%計(jì)為3分。取兩組計(jì)分之和，評分>2分地為陽性表達(dá)，≤2分計(jì)為陰性表達(dá)。

1.2.4隨訪 結(jié)腸癌患者進(jìn)行3年隨訪，隨訪截止日期為2018年5月，隨訪方式：電話或門診復(fù)查，統(tǒng)計(jì)患者總生存期(OS)即從隨機(jī)開始至因任何原因引起死亡的時間。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、受試者工作特征(ROC)曲線、Pearson相關(guān)分析、多因素分析。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)腸癌患者血清中YKL-40、RSK4、cyclinD1 mRNA表達(dá)水平比較 與對照組相比，結(jié)腸癌組血清中YKL-40、cyclinD1 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(均P<0.001)，而RSK4 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)，見表1。

表1 結(jié)腸癌患者血清中YKL-40、RSK4、cyclinD1 mRNA表達(dá)水平比較

2.2結(jié)腸癌及癌旁組織中YKL-40、RSK4、cyclinD1陽性表達(dá)率比較 免疫組化組顯示YKL-40、cyclinD1、RSK4染色呈黃色、棕黃色、褐色，見圖1。與癌旁組織相比，結(jié)腸癌組織YKL-40、cyclinD1蛋白陽性表達(dá)率顯著增強(qiáng)(P<0.05)，RSK4蛋白陽性表達(dá)率顯著減弱(P<0.05)，見表2。

圖1 結(jié)腸癌組織中YKL-40、RSK4、cyclinD1蛋白表達(dá)(DAB，×200)

表2 結(jié)腸癌及癌旁組織中YKL-40、RSK4、cyclinD1陽性表達(dá)率比較〔n(%)，n=86〕

2.3YKL-40、RSK4、cyclinD1在結(jié)腸癌中的表達(dá)相關(guān)性分析 RSK4表達(dá)與YKL-40表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.333，P=0.002)，RSK4表達(dá)與cyclinD1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.309，P=0.004)，YKL-40表達(dá)與cyclinD1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.224，P=0.038)，見圖2。

圖2 結(jié)腸癌中YKL-40、RSK4、cyclinD1表達(dá)的相關(guān)性

2.4YKL-40、RSK4、cyclinD1聯(lián)合檢測對結(jié)腸癌的診斷價(jià)值分析 ROC分析YKL-40、RSK4、cyclinD1對結(jié)腸癌的診斷價(jià)值，YKL-40表達(dá)水平診斷結(jié)腸癌的敏感性為62.79%，特異性為57.14%，曲線下面積(AUC)面積為0.783(95%CI：0.706～0.848)；RSK4表達(dá)水平診斷結(jié)腸癌的敏感性為41.86%，特異性為89.29%，AUC面積為0.605(95%CI：0.520～0.686)；cyclinD1表達(dá)水平診斷結(jié)腸癌的敏感性為54.65%，特異性為69.64%，AUC面積為0.690(95%CI：0.607～0.765)；聯(lián)合檢測診斷結(jié)腸癌的敏感性為94.19%，特異性為98.21%，AUC面積為0.985(95%CI：0.949～0.998)，聯(lián)合檢測診斷敏感性顯著高于單項(xiàng)檢測(P<0.05)，見圖3。

圖3 YKL-40、RSK4、cyclinD1聯(lián)合檢測對結(jié)腸癌的診斷價(jià)值

2.5YKL-40、RSK4、cyclinD1表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性 YKL-40陽性表達(dá)、cyclinD1陽性表達(dá)、RSK4陽性表達(dá)與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤、TNM分期、分化程度相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、腫瘤位置、病理分型、腫瘤直徑、病理類型無相關(guān)性(P>0.05)，見表3。

表3 YKL-40、RSK4、cyclinD1陽性表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性〔n(%)〕

2.6YKL-40、RSK4、cyclinD1表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析 Kaplan-Meier曲線顯示，YKL-40、RSK4、cyclinD1均與患者OS密切相關(guān)。YKL-40陰性表達(dá)組生存率(40.23%)高于陽性表達(dá)組(19.88%)，cyclinD1陰性表達(dá)組生存率(51.28%)高于陽性表達(dá)組(18.76%)，RSK4陽性表達(dá)組生存率(43.56%)高于陰性表達(dá)組(18.83%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見圖4。

圖4 結(jié)腸癌患者YKL-40、RSK4、cyclinD1表達(dá)與生存率的關(guān)系

2.7影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的Cox回歸分析 將影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的因素進(jìn)行COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸多因素分析，以浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤、TNM分期、分化程度、YKL-40表達(dá)、RSK4表達(dá)、cyclinD1表達(dá)為自變量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、YKL-40表達(dá)、RSK4表達(dá)、cyclinD1表達(dá)是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表4。

表4 影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的Cox分析

3 討 論

據(jù)調(diào)查顯示，近年來，結(jié)腸癌發(fā)病率逐年增加，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)及基因檢測的發(fā)展，越來越多的腫瘤標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)成為提高結(jié)腸癌患者生存率的重點(diǎn)研究方向〔7〕。但結(jié)腸癌早期篩查指標(biāo)的靈敏度及特異度較低導(dǎo)致其診斷效率降低〔8〕。結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，研究表明基因表達(dá)異?？纱龠M(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞分化或促進(jìn)癌癥發(fā)生發(fā)展〔9〕。因此本研究擬探尋結(jié)腸癌早期診斷及其預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子。

YKL-40在卵巢癌等腫瘤組織中呈高表達(dá)，并可作為評估患者預(yù)后的分子標(biāo)志物〔10〕。研究表明子宮內(nèi)膜癌組織及血清中YKL-40的表達(dá)水平明顯升高，并可作為早期診斷子宮內(nèi)膜癌的重要輔助標(biāo)志物〔11〕。乳腺癌患者血清中YKL-40的表達(dá)水平升高，其高表達(dá)量與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并可作為判斷乳腺癌患者預(yù)后的預(yù)測因子〔12〕。與上述研究報(bào)道相似，本研究結(jié)果提示YKL-40表達(dá)水平升高可能促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生。研究表明cyclinD1在肺癌組織中呈高表達(dá)，并可作為評估肺癌患者預(yù)后的參考指標(biāo)〔13〕。結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞周期失控有關(guān)，研究表明cyclinD1在腫瘤組織中呈高表達(dá)，其表達(dá)量升高可促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，抑制cyclinD1的表達(dá)可降低細(xì)胞增殖能力〔14，15〕。本研究結(jié)果提示cyclinD1表達(dá)水平升高可能促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生，YKL-40可能正向調(diào)控cyclinD1表達(dá)參與結(jié)腸癌的發(fā)生過程。

RSK4在胰腺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，并可參與腫瘤細(xì)胞凋亡、遷移及侵襲等過程〔16，17〕。研究表明RSK4還可通過調(diào)控細(xì)胞周期影響腫瘤細(xì)胞增殖及分化〔18，19〕。相關(guān)報(bào)道指出RSK4在乳腺癌組織中表達(dá)水平降低，并可影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程〔20，21〕。本研究結(jié)果提示，YKL-40、cyclinD1在結(jié)腸癌中呈高表達(dá)，RSK4表達(dá)降低，RSK4與YKL-40、cyclinD1在結(jié)腸癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而YKL-40與cyclinD1在結(jié)腸癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，YKL-40、cyclinD1、RSK4表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等臨床病理特征密切相關(guān)，并可作為評估患者預(yù)后的重要指標(biāo)，聯(lián)合檢測血清YKL-40、cyclinD1、RSK4表達(dá)水平可提高結(jié)腸癌診斷效率，可為結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制及臨床診斷提供參考依據(jù)。但結(jié)腸癌中YKL-40、cyclinD1、RSK4之間是否存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。