郭彩珍

(呂梁學(xué)院生命科學(xué)系， 山西 呂梁 033000)

anti-browning agent

紫丁香(SyringaoblataLind.)別名丁香、華北紫丁香、百結(jié)、情客，具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。紫丁香的葉和樹(shù)皮均可入藥；從紫丁香中提取的紫丁香苷有強(qiáng)烈的抗肝毒作用[1-2]。但因紫丁香是木本植物，相比較草本植物需要較長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，這是利用傳統(tǒng)育種方法改良其性狀的主要障礙，所以木本植物的遺傳轉(zhuǎn)化遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于草本植物，而利用植物細(xì)胞離體培養(yǎng)技術(shù)對(duì)研究紫丁香的高頻再生體系及高效遺傳轉(zhuǎn)化體系都有一定幫助[3]。

植物外植體在進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)，容易發(fā)生組織和細(xì)胞的褐化、玻璃化及枯死現(xiàn)象[4-5]，會(huì)很大程度地影響組織細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖以及其愈傷組織的誘導(dǎo)。關(guān)于紫丁香的栽培及化學(xué)成分的研究等方面已有過(guò)報(bào)道，但是對(duì)其外植體進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織方面的研究較少[6-7]。本試驗(yàn)以紫丁香為材料，從最佳外植體的篩選、愈傷組織誘導(dǎo)條件的優(yōu)化及不同抗褐化劑對(duì)紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)情況的影響方面進(jìn)行綜合研究，以期為紫丁香植物資源保護(hù)和愈傷組織的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

紫丁香采自呂梁學(xué)院校園內(nèi)。采用的試劑為6-BA、NAA、2,4-D(均為分析純)；聚乙烯吡咯炕酮(PVP)、活性炭(AC)、檸檬酸(CA)。

2 方 法

2.1 紫丁香誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體篩選

先將紫丁香的根、莖、葉和花用紫外燈滅菌30 min，后依次用75%酒精浸泡30 s、0.1%次氯酸鈉消毒20 min、蒸餾水沖洗4～5次，將紫丁香葉、莖和花剪成0.5 cm×0.5 cm大小，根長(zhǎng)大約為0.5 cm[5]，然后在改良的MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2,4-D 0.4 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1培養(yǎng)基上進(jìn)行接種，光照13 h·d-1，溫度(23±2)℃，經(jīng)過(guò)3周的培養(yǎng)后觀察其愈傷組織的生長(zhǎng)情況及誘導(dǎo)率：

誘導(dǎo)率(%)=(紫丁香誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)目/紫丁香共接種的外植體數(shù))×100%，

同時(shí)觀察愈傷組織生長(zhǎng)狀況：+++為生長(zhǎng)非常好、++為生長(zhǎng)較好、+為生長(zhǎng)非常差，根據(jù)指標(biāo)進(jìn)行誘導(dǎo)紫丁香愈傷組織最佳外植體的篩選。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

按表1中的激素濃度比例配置MS培養(yǎng)基，進(jìn)行紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)的單因素試驗(yàn)。進(jìn)行3周的培養(yǎng)后觀察其愈傷組織的質(zhì)地、生長(zhǎng)情況和愈傷組織數(shù)目，根據(jù)公式進(jìn)行其誘導(dǎo)率的計(jì)算。

表1 單因素試驗(yàn)濃度

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素和水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化紫丁香愈傷組織的誘導(dǎo)工藝

利用Design-Expert 8.0.6軟件按照表2中的因素水平進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以紫丁香愈傷組織的誘導(dǎo)率為響應(yīng)值，優(yōu)化紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)的工藝。

2.4 不同抗褐化劑對(duì)紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在經(jīng)過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)確定的最佳改良MS培養(yǎng)基中分別添加不同的抗褐化劑(AC、PVP、CA)見(jiàn)表3，對(duì)紫丁香莖愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察3周后記錄外植體褐化和愈傷誘導(dǎo)狀況，從中選出其最佳的抗褐化劑。

表3 不同濃度的抗褐化劑Table 3 Different concentrations of anti-browning agents

目視觀察其愈傷組織的褐化程度：-表示培養(yǎng)基成半透明狀，無(wú)褐化情況；+表示其切口處有褐色物質(zhì)；++表示培養(yǎng)基有少許的變色，切口處有褐色物質(zhì)；+++表示周?chē)囵B(yǎng)基大范圍變色及發(fā)生嚴(yán)重褐變；++++表示培養(yǎng)基周?chē)猩疃群谏鞍l(fā)生嚴(yán)重褐變。

愈傷組織大小的判斷標(biāo)準(zhǔn)：A是其愈傷的直徑大于0.5 cm；B是其愈傷的直徑大于0.3 cm；C是其愈傷的直徑小于0.3 cm。

褐化率(%)=(愈傷組織發(fā)生褐化的數(shù)目/共接種的數(shù)目)×100%

3 結(jié)果與分析

3.1 最佳外植體篩選

將紫丁香4種外植體接種到改良培養(yǎng)基中，進(jìn)行3周的愈傷組織誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)，都可以成功誘導(dǎo)出其愈傷組織，但其愈傷組織間有較大差異。由表4可見(jiàn)，莖的誘導(dǎo)率最高，達(dá)83.3%，且褐化率較低及生長(zhǎng)狀況較好；葉誘導(dǎo)率為56.7%，褐化率為40%；根的誘導(dǎo)率較高，為73.3%，但褐化嚴(yán)重、生長(zhǎng)狀況較差；花的誘導(dǎo)率最低，為46.7%，但生長(zhǎng)狀況非常差。綜合分析，誘導(dǎo)紫丁香愈傷組織的最佳外植體是莖。

表4 不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)情況Table 4 Comparison of callus induction from different explants

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

3.2.16-BA對(duì)紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表5可知，當(dāng)2,4-D和NAA濃度一定，6-BA濃度達(dá)到0.5 mg·L-1時(shí)，紫丁香愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，達(dá)76.7%,且愈傷組織生長(zhǎng)狀況非常好；當(dāng)濃度低于或高于0.5 mg·L-1時(shí)，其誘導(dǎo)率呈下降趨勢(shì)且生長(zhǎng)狀況較差。如果培養(yǎng)基中分裂素的含量超過(guò)一定值時(shí)，會(huì)相應(yīng)抑制其愈傷組織的誘導(dǎo)[10]。因此，6-BA濃度為0.5 mg·L-1時(shí)紫丁香愈傷組織的誘導(dǎo)率最高且生長(zhǎng)情況最好。

表5 6-BA對(duì)紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 5 Effects of 6-BA on callus induction from S. oblata stem

3.2.22,4-D對(duì)紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表6可知，當(dāng)6-BA與NAA濃度一定，2,4-D濃度達(dá)到0.3 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率達(dá)到最高，愈傷組織的生長(zhǎng)情況也是最好；但當(dāng)2,4-D濃度低于或高于0.3 mg·L-1時(shí)，其愈傷組織的誘導(dǎo)率下降，生長(zhǎng)狀況較差。適度的生長(zhǎng)素濃度會(huì)在一定程度上促進(jìn)愈傷組織的形成，而如果生長(zhǎng)素的濃度過(guò)高時(shí)又會(huì)升高多酚氧化酶的活性，使褐化加重[10-11]。因此，2,4-D濃度為0.3 mg·L-1時(shí)，紫丁香愈傷組織的誘導(dǎo)率最高且生長(zhǎng)情況最好。

表6 2,4-D對(duì)紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 6 Effects of 2,4-D on callus induction from S. oblata stem

3.2.3NAA對(duì)紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表7可知，當(dāng)2,4-D與6-BA濃度一定，NAA濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，其誘導(dǎo)率達(dá)到最高；但當(dāng)NAA濃度低于或高于0.2 mg·L-1時(shí)，其誘導(dǎo)率開(kāi)始下降，愈傷組織的生長(zhǎng)狀況非常差。由此可見(jiàn)，紫丁香愈傷組織誘導(dǎo)的NAA濃度最佳為0.2mg·L-1。

表7 NAA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 7 Effects of NAA on callus induction

3.3 利用響應(yīng)面法對(duì)紫丁香莖愈傷組織的誘導(dǎo)工藝進(jìn)行優(yōu)化

3.3.1建立模型和方差分析

利用響應(yīng)面法，根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件建立3因素3水平的組合試驗(yàn)，優(yōu)化紫丁香愈傷組織的誘導(dǎo)工藝，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 響應(yīng)面法試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 8 Tested data from response surface method

對(duì)表8的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合后，得到其回歸方程：

誘導(dǎo)率=-26.490 00+203.750 00×6-BA+266.650 00×2,4-D+93.600 00×NAA-7.500 00×6-BA×2,4-D+2.500 00×6-BA×NAA+67.500 00×2,4-D×NAA-172.750 00×6-BA2-427.750 00×2,4-D2-272.750 00×NAA2

根據(jù)方差分析和顯著性檢驗(yàn)的結(jié)果(表9)可知：該回歸模型的p<0.000 1極顯著，失擬項(xiàng)(p=0.164 8>0.05)不顯著，表明該響應(yīng)面的回歸模型擬合度良好，能較好地預(yù)測(cè)和分析紫丁香愈傷組織的誘導(dǎo)率。其各影響因素都對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率有顯著影響但其影響大小不同，影響紫丁香愈傷組織誘導(dǎo)率的顯著性順序?yàn)?-BA>2,4-D>NAA。

表9 方差分析Table 9 Variance analysis

3.3.2各影響因素的交互作用分析

紫丁香愈傷組織誘導(dǎo)率與各工藝條件之間的響應(yīng)面和等高線見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

通過(guò)紫丁香愈傷組織誘導(dǎo)率與各工藝條件之間的響應(yīng)面和等高線，可以反映出各因素之間的交互作用對(duì)其響應(yīng)值影響的顯著性，各因素間相互作用越強(qiáng)響應(yīng)面的曲線越陡[8-9]。 圖1、圖2、圖3表明，6-BA和NAA、NAA和2,4-D、6-BA和2,4-D之間的相互作用對(duì)其誘導(dǎo)率的影響相對(duì)較小，這個(gè)結(jié)論與方差分析的結(jié)果一致。

3.3.3模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析：誘導(dǎo)紫丁香莖段愈傷組織的最佳配比為6-BA濃度為0.5 mg·L-1，NAA濃度為0.2 mg·L-1，2,4-D濃度為0.3 mg·L-1，在此條件下重復(fù)3次試驗(yàn)，其誘導(dǎo)率平均為84.5%。由此可知通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化誘導(dǎo)條件的參數(shù)可靠，可用于實(shí)際操作。

3.4 抗褐化劑對(duì)紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)情況的影響

抗褐化劑的種類(lèi)和濃度對(duì)紫丁香莖愈傷組織生長(zhǎng)狀況的影響見(jiàn)表10。3種抗褐化劑對(duì)其生長(zhǎng)情況都能產(chǎn)生一定影響,紫丁香外植體褐化程度為AC

表10 抗褐化劑種類(lèi)和濃度對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響Table 10 Effects of types and concentrations of anti-browning agents on callus growth

4 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，紫丁香莖段為愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體；其誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為：MS+6-BA 0.50 mg·L-1+2,4-D 0.3 mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1；紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)的最佳抗褐化劑是濃度為0.2 g·L-1的CA。

植物生長(zhǎng)激素在誘導(dǎo)愈傷組織的過(guò)程中起到非常重要的作用，而生長(zhǎng)激素種類(lèi)和含量不同，其誘導(dǎo)愈傷組織的影響也不同[10]；褐化問(wèn)題在愈傷組織培養(yǎng)過(guò)程中普遍存在，這兩方面都對(duì)誘導(dǎo)外植體的脫分化和再分化有重大影響[11]。在本次試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其不同濃度對(duì)紫丁香愈傷組織的影響是有差異的；PVP與AC作為無(wú)機(jī)吸附劑，其吸附性較好，能夠防止植物體自身酚類(lèi)物質(zhì)的排出。而CA是抗氧化劑，可以通過(guò)改變周?chē)难趸€原電勢(shì)而抑制酚類(lèi)物質(zhì)氧化，但是具體的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。