郭彩珍

(呂梁學院生命科學系， 山西 呂梁 033000)

anti-browning agent

紫丁香(SyringaoblataLind.)別名丁香、華北紫丁香、百結、情客，具有較強的適應能力。紫丁香的葉和樹皮均可入藥；從紫丁香中提取的紫丁香苷有強烈的抗肝毒作用[1-2]。但因紫丁香是木本植物，相比較草本植物需要較長的營養(yǎng)生長期，這是利用傳統(tǒng)育種方法改良其性狀的主要障礙，所以木本植物的遺傳轉化遠遠落后于草本植物，而利用植物細胞離體培養(yǎng)技術對研究紫丁香的高頻再生體系及高效遺傳轉化體系都有一定幫助[3]。

植物外植體在進行離體培養(yǎng)時，容易發(fā)生組織和細胞的褐化、玻璃化及枯死現象[4-5]，會很大程度地影響組織細胞的生長繁殖以及其愈傷組織的誘導。關于紫丁香的栽培及化學成分的研究等方面已有過報道，但是對其外植體進行誘導愈傷組織方面的研究較少[6-7]。本試驗以紫丁香為材料，從最佳外植體的篩選、愈傷組織誘導條件的優(yōu)化及不同抗褐化劑對紫丁香莖愈傷組織誘導情況的影響方面進行綜合研究，以期為紫丁香植物資源保護和愈傷組織的進一步開發(fā)利用提供一定的科學依據。

1 材 料

紫丁香采自呂梁學院校園內。采用的試劑為6-BA、NAA、2,4-D(均為分析純)；聚乙烯吡咯炕酮(PVP)、活性炭(AC)、檸檬酸(CA)。

2 方 法

2.1 紫丁香誘導愈傷組織的最佳外植體篩選

先將紫丁香的根、莖、葉和花用紫外燈滅菌30 min，后依次用75%酒精浸泡30 s、0.1%次氯酸鈉消毒20 min、蒸餾水沖洗4～5次，將紫丁香葉、莖和花剪成0.5 cm×0.5 cm大小，根長大約為0.5 cm[5]，然后在改良的MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2,4-D 0.4 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1培養(yǎng)基上進行接種，光照13 h·d-1，溫度(23±2)℃，經過3周的培養(yǎng)后觀察其愈傷組織的生長情況及誘導率：

誘導率(%)=(紫丁香誘導出愈傷組織的外植體數目/紫丁香共接種的外植體數)×100%，

同時觀察愈傷組織生長狀況：+++為生長非常好、++為生長較好、+為生長非常差，根據指標進行誘導紫丁香愈傷組織最佳外植體的篩選。

2.2 單因素實驗

按表1中的激素濃度比例配置MS培養(yǎng)基，進行紫丁香莖愈傷組織誘導的單因素試驗。進行3周的培養(yǎng)后觀察其愈傷組織的質地、生長情況和愈傷組織數目，根據公式進行其誘導率的計算。

表1 單因素試驗濃度

表2 響應面實驗的因素和水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments

2.3 響應面法優(yōu)化紫丁香愈傷組織的誘導工藝

利用Design-Expert 8.0.6軟件按照表2中的因素水平進行響應面實驗，以紫丁香愈傷組織的誘導率為響應值，優(yōu)化紫丁香莖愈傷組織誘導的工藝。

2.4 不同抗褐化劑對紫丁香莖愈傷組織誘導的影響

在經過響應面試驗確定的最佳改良MS培養(yǎng)基中分別添加不同的抗褐化劑(AC、PVP、CA)見表3，對紫丁香莖愈傷組織進行誘導，觀察3周后記錄外植體褐化和愈傷誘導狀況，從中選出其最佳的抗褐化劑。

表3 不同濃度的抗褐化劑Table 3 Different concentrations of anti-browning agents

目視觀察其愈傷組織的褐化程度：-表示培養(yǎng)基成半透明狀，無褐化情況；+表示其切口處有褐色物質；++表示培養(yǎng)基有少許的變色，切口處有褐色物質；+++表示周圍培養(yǎng)基大范圍變色及發(fā)生嚴重褐變；++++表示培養(yǎng)基周圍有深度黑色及發(fā)生嚴重褐變。

愈傷組織大小的判斷標準：A是其愈傷的直徑大于0.5 cm；B是其愈傷的直徑大于0.3 cm；C是其愈傷的直徑小于0.3 cm。

褐化率(%)=(愈傷組織發(fā)生褐化的數目/共接種的數目)×100%

3 結果與分析

3.1 最佳外植體篩選

將紫丁香4種外植體接種到改良培養(yǎng)基中，進行3周的愈傷組織誘導后發(fā)現，都可以成功誘導出其愈傷組織，但其愈傷組織間有較大差異。由表4可見，莖的誘導率最高，達83.3%，且褐化率較低及生長狀況較好；葉誘導率為56.7%，褐化率為40%；根的誘導率較高，為73.3%，但褐化嚴重、生長狀況較差；花的誘導率最低，為46.7%，但生長狀況非常差。綜合分析，誘導紫丁香愈傷組織的最佳外植體是莖。

表4 不同外植體愈傷組織的誘導情況Table 4 Comparison of callus induction from different explants

3.2 單因素實驗

3.2.16-BA對紫丁香莖愈傷組織誘導的影響

由表5可知，當2,4-D和NAA濃度一定，6-BA濃度達到0.5 mg·L-1時，紫丁香愈傷組織的誘導率最高，達76.7%,且愈傷組織生長狀況非常好；當濃度低于或高于0.5 mg·L-1時，其誘導率呈下降趨勢且生長狀況較差。如果培養(yǎng)基中分裂素的含量超過一定值時，會相應抑制其愈傷組織的誘導[10]。因此，6-BA濃度為0.5 mg·L-1時紫丁香愈傷組織的誘導率最高且生長情況最好。

表5 6-BA對紫丁香莖愈傷組織誘導的影響Table 5 Effects of 6-BA on callus induction from S. oblata stem

3.2.22,4-D對紫丁香莖愈傷組織誘導的影響

由表6可知，當6-BA與NAA濃度一定，2,4-D濃度達到0.3 mg·L-1時，誘導率達到最高，愈傷組織的生長情況也是最好；但當2,4-D濃度低于或高于0.3 mg·L-1時，其愈傷組織的誘導率下降，生長狀況較差。適度的生長素濃度會在一定程度上促進愈傷組織的形成，而如果生長素的濃度過高時又會升高多酚氧化酶的活性，使褐化加重[10-11]。因此，2,4-D濃度為0.3 mg·L-1時，紫丁香愈傷組織的誘導率最高且生長情況最好。

表6 2,4-D對紫丁香莖愈傷組織誘導的影響Table 6 Effects of 2,4-D on callus induction from S. oblata stem

3.2.3NAA對紫丁香莖愈傷組織誘導的影響

從表7可知，當2,4-D與6-BA濃度一定，NAA濃度為0.2 mg·L-1時，其誘導率達到最高；但當NAA濃度低于或高于0.2 mg·L-1時，其誘導率開始下降，愈傷組織的生長狀況非常差。由此可見，紫丁香愈傷組織誘導的NAA濃度最佳為0.2mg·L-1。

表7 NAA對愈傷組織誘導的影響Table 7 Effects of NAA on callus induction

3.3 利用響應面法對紫丁香莖愈傷組織的誘導工藝進行優(yōu)化

3.3.1建立模型和方差分析

利用響應面法，根據Design-Expert 8.0.6軟件建立3因素3水平的組合試驗，優(yōu)化紫丁香愈傷組織的誘導工藝，結果見表8。

表8 響應面法試驗數據Table 8 Tested data from response surface method

對表8的試驗數據進行回歸擬合后，得到其回歸方程：

誘導率=-26.490 00+203.750 00×6-BA+266.650 00×2,4-D+93.600 00×NAA-7.500 00×6-BA×2,4-D+2.500 00×6-BA×NAA+67.500 00×2,4-D×NAA-172.750 00×6-BA2-427.750 00×2,4-D2-272.750 00×NAA2

根據方差分析和顯著性檢驗的結果(表9)可知：該回歸模型的p<0.000 1極顯著，失擬項(p=0.164 8>0.05)不顯著，表明該響應面的回歸模型擬合度良好，能較好地預測和分析紫丁香愈傷組織的誘導率。其各影響因素都對愈傷組織的誘導率有顯著影響但其影響大小不同，影響紫丁香愈傷組織誘導率的顯著性順序為6-BA>2,4-D>NAA。

表9 方差分析Table 9 Variance analysis

3.3.2各影響因素的交互作用分析

紫丁香愈傷組織誘導率與各工藝條件之間的響應面和等高線見圖1、圖2、圖3。

通過紫丁香愈傷組織誘導率與各工藝條件之間的響應面和等高線，可以反映出各因素之間的交互作用對其響應值影響的顯著性，各因素間相互作用越強響應面的曲線越陡[8-9]。 圖1、圖2、圖3表明，6-BA和NAA、NAA和2,4-D、6-BA和2,4-D之間的相互作用對其誘導率的影響相對較小，這個結論與方差分析的結果一致。

3.3.3模型的驗證實驗

根據軟件對試驗結果進行分析：誘導紫丁香莖段愈傷組織的最佳配比為6-BA濃度為0.5 mg·L-1，NAA濃度為0.2 mg·L-1，2,4-D濃度為0.3 mg·L-1，在此條件下重復3次試驗，其誘導率平均為84.5%。由此可知通過響應面法優(yōu)化誘導條件的參數可靠，可用于實際操作。

3.4 抗褐化劑對紫丁香莖愈傷組織誘導情況的影響

抗褐化劑的種類和濃度對紫丁香莖愈傷組織生長狀況的影響見表10。3種抗褐化劑對其生長情況都能產生一定影響,紫丁香外植體褐化程度為AC

表10 抗褐化劑種類和濃度對愈傷組織生長的影響Table 10 Effects of types and concentrations of anti-browning agents on callus growth

4 結論與討論

試驗結果表明，紫丁香莖段為愈傷組織誘導的最佳外植體；其誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為：MS+6-BA 0.50 mg·L-1+2,4-D 0.3 mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1；紫丁香莖愈傷組織誘導的最佳抗褐化劑是濃度為0.2 g·L-1的CA。

植物生長激素在誘導愈傷組織的過程中起到非常重要的作用，而生長激素種類和含量不同，其誘導愈傷組織的影響也不同[10]；褐化問題在愈傷組織培養(yǎng)過程中普遍存在，這兩方面都對誘導外植體的脫分化和再分化有重大影響[11]。在本次試驗中發(fā)現3種植物生長調節(jié)劑及其不同濃度對紫丁香愈傷組織的影響是有差異的；PVP與AC作為無機吸附劑，其吸附性較好，能夠防止植物體自身酚類物質的排出。而CA是抗氧化劑，可以通過改變周圍的氧化還原電勢而抑制酚類物質氧化，但是具體的作用機理還有待進一步研究。