焦芳嬋， 童治軍， 方敦煌， 肖炳光， 袁欣婕， 陳學(xué)軍， 李永平

(1.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 昆明 650021；2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所， 南昌 330200)

普通煙草花葉病(Tobacco mosaic virus，TMV)是云南等煙葉主產(chǎn)區(qū)分布廣、為害重的主要病害之一[1]，TMV廣泛存在于活體寄主、植物殘?bào)w、大田土壤，即使在低溫和高溫條件仍能保持一定的病毒侵染活力[2]，而且其寄主范圍非常廣，能侵染茄科(煙草、番茄、茄子)、葫蘆科(西瓜)、十字花科(油麥菜)等[3]。

選育抗TMV的品種，是應(yīng)對(duì)TMV為害最為經(jīng)濟(jì)和有效的手段。野生煙草-心葉煙中含有顯性單基因TMV免疫基因N，前人已將N基因轉(zhuǎn)育到了栽培煙草，N基因也是人類首次克隆的植物抗病基因[4]。我國(guó)利用該抗源已選育10多個(gè)高抗TMV的煙草品種[5-9]，但由于連鎖累贅的存在，迄今仍沒(méi)有適宜的高抗TMV的烤煙品種進(jìn)行大規(guī)模推廣種植[10]。除了利用煙草基因組序列數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物，從大批量的雜交后代篩選短的抗TMV片段外[11]，從野生煙草資源中，轉(zhuǎn)育新的TMV抗源也是應(yīng)對(duì)措施之一。Yuan等[12]報(bào)道，在圓錐煙草(N.paniculataPI 555550)等煙屬野生種中，其高抗TMV的特性由N基因家族其他成員提供。但迄今尚未見(jiàn)N基因同源基因片段(簡(jiǎn)稱N同源片段，下同)轉(zhuǎn)入栽培煙草的報(bào)道。本試驗(yàn)利用烤煙品種紅花大金元與圓錐煙草(N.paniculata)開(kāi)展種間遠(yuǎn)緣雜交研究，以期將新的TMV抗性基因?qū)朐耘酂煵?，?chuàng)制新的抗病種質(zhì)資源，為選育抗TMV的煙草品種提供材料與數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用材料為烤煙主栽品種紅花大金元(簡(jiǎn)稱HD，染色體2 n=48)、圓錐煙草(N.paniculataPI 555550簡(jiǎn)稱Np 555550，染色體2 n=24)、含有N基因的栽培煙草RBST及野生煙草(N.glutinosa)由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。

1.2 雜 交

分別以HD、Np 555550做父母本，進(jìn)行正反雜交，每個(gè)組合進(jìn)行20個(gè)左右雜交，以紙管法套袋，一周后統(tǒng)計(jì)雜交結(jié)實(shí)率(即坐果數(shù)與雜交花的比值)。

1.3 雜交種SSR及GISH分析

以QIAGEN DNeasy plant kit試劑盒提取雜交種及雙親DNA。SSR-PCR擴(kuò)增體系為20 μL，其中DNA樣品1.5 μL(15～30 ng·μL-1)、10×PCR Reaction Buffer(Mg2+plus)2 μL、25 mmol·L-1dNTPs 1.2 L、10 μmol·L-1正、反向引物各2 μL、rTaq0.75 U，最后加水至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共計(jì)30個(gè)循環(huán)。參照Bindler等[13]、童治軍等[14]所用SSR引物表，篩選10對(duì)SSR引物進(jìn)行SSR分析。

基因組前處理，液氮研磨提取體細(xì)胞雜交種基因組DNA，用Hind Ⅲ酶切純化，用ROCHE的DIG HIGH PRIME DNA標(biāo)記試劑盒對(duì)基因組進(jìn)行地高辛標(biāo)記。GISH分析參照Mark W.Chase等[15]的方法進(jìn)行標(biāo)記探針、壓片、烘片、制片預(yù)處理、洗脫等處理。

1.4 Np基因特異標(biāo)記開(kāi)發(fā)及雜交種的抗性鑒定

參照Lewis R.S等[10]及Yuan等[12]的方法，分別合成N基因及Np基因特異引物，其中Np基因特異引物經(jīng)過(guò)PCR篩選，選定solo-F 1-TGATGCACAAAGATCCCGTT+solo-R 2-GACCTCTGTGCATTCATCTTATCA為Np基因特異引物。以雙親及雜交種、RBST及N.glutinosa為模版，進(jìn)行N基因片段及Np基因片段PCR擴(kuò)增。

1.5 TMV接種抗性鑒定

參考周文兵等[16]的方法，即半葉枯斑法接種TMV，在25 ℃溫室自然光照下，以10 mg·mL-1的0.2 mL花葉病病毒汁液摩擦接種半葉，另外一半涂去離子水(ck)，共接種6片葉子，觀察雜交種是否有枯斑來(lái)判定抗病性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Np 555550和HD的遠(yuǎn)緣雜交

以HD及Np 555550為雙親，通過(guò)正、反交兩種方法進(jìn)行雜交(見(jiàn)表1)。由表1可以看出，染色體數(shù)目多的栽培煙草紅大為母本，其雜交結(jié)實(shí)率為0，而以圓錐煙草為母本，其雜交結(jié)實(shí)率達(dá)36.8%。

表1 紅花大金元及圓錐煙草N.paniculata(PI 555550)雜交結(jié)實(shí)結(jié)果Table 1 Fruiting results of cross between N. tabacum (Honghuadajinyuan) and N. paniculata (PI 555550)

2.2 雜交種的SSR及GISH鑒定

10對(duì)SSR引物中，TM 100有穩(wěn)定的擴(kuò)增效果，其序列為：TM 100 F 5’-TGGAGGAACCAACAAGGAAG-3’及TM 100 R 5’-GTCCGACAGTATCTTCGCAA-3’。遠(yuǎn)緣雜交種F1含雙親帶(圖1)。

F1雜交種的GISH鑒定表明，母本用地高辛標(biāo)記，用Rhodamine anti-DIG-sheep顯紅色熒光，父本用生物素標(biāo)記，用Alexafluor 488 Streptavidin顯綠色熒光，母本父本重合的染色體是黃色熒光。紅色熒光共計(jì)8條，綠色熒光共計(jì)4條，黃色熒光(紅綠重合)共計(jì)28條，總?cè)旧w條數(shù)共計(jì)40條(圖2)。

2.3 Np基因特異標(biāo)記開(kāi)發(fā)及雜交種的抗性鑒定

N基因片段及Np基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖3～圖4)表明，圓錐煙草及雜交種不能擴(kuò)增出540 bpN基因特異片段，而可以擴(kuò)增出500 bp大小的Np基因片段。

對(duì)紅花大金元、N.paniculata及其F1苗期人工接種TMV，接種7 d后，紅花大金元出現(xiàn)花葉癥狀，N.paniculata和雜交種全部為枯斑、對(duì)TMV表現(xiàn)免疫(表2、圖5)。

表2 雜交種TMV抗性鑒定結(jié)果Table 2 Identification of TMV resistance of hybrid

3 討 論

截止2017年，國(guó)內(nèi)煙草相關(guān)研究單位對(duì)2 000余份種質(zhì)資源(包含重復(fù)鑒定資源)開(kāi)展過(guò)TMV抗性鑒定[14-22]，其中大部分表現(xiàn)枯斑的煙草資源包括烤煙、白肋煙、香料煙、曬煙、雪茄煙，不包括黃花煙、野生煙等[11]，且這些資源的抗性都來(lái)自于N基因。目前國(guó)內(nèi)外利用抗TMV資源選育的抗TMV煙草品種因?yàn)檫B鎖累贅，在生產(chǎn)上的推廣年限不長(zhǎng)、推廣面積不大。尋找新的TMV抗源是勢(shì)在必行，而在野生煙草中具有普通煙草所不具有的一些重要基因，尤其是抗病抗蟲(chóng)基因。

Yuan等[12]研究表明，N.paniculata煙草中Np基因(GenBank:KP 278475)編碼區(qū)有3 393個(gè)核苷酸，與N基因的編碼區(qū)序列有205個(gè)SNPs差異，一個(gè)8核苷酸的缺失和一個(gè)3核苷酸的插入，核苷酸一致性為93.9%。Np基因中8核苷酸的缺失導(dǎo)致其后11個(gè)氨基酸序列與N蛋白中的序列不同。在203個(gè)位于8核苷酸缺失前的SNPs中，有137個(gè)引起氨基酸替換。203個(gè)SNPs中23個(gè)位于LRR區(qū)域內(nèi)的高度變異位點(diǎn)，其中21個(gè)引起氨基酸的替換。其余116個(gè)位于8核苷酸缺失前的非同義突變SNPs分布于不同的區(qū)域：14個(gè)位于TIR區(qū)域，34個(gè)位于NBS區(qū)域，27個(gè)位于LRR區(qū)域，41個(gè)位于其他區(qū)域。N基因與N同源片段的高度變異位點(diǎn)的Ka/Ks比值為1.87，說(shuō)明這兩個(gè)基因在N.glutinosa和N.paniculata物種分化后受到了多樣化選擇。本研究以圓錐煙草為母本，將圓錐煙草的N基因同源基因Np片段轉(zhuǎn)育到栽培煙草紅花大金元中，為烤煙抗病育種提供了新的種質(zhì)材料。

H.C.Sharma[17]在其他作物的遠(yuǎn)緣雜交結(jié)果表明，遠(yuǎn)緣雜交由于親本間的基因組成存在較大差異，雜種一般以染色體數(shù)較多或染色體倍性高的作母本，更易克服雜交障礙獲得遠(yuǎn)緣雜交種。本研究以染色體數(shù)少的圓錐煙草為母本，栽培煙草為父本也同樣獲得了雜交種，但其具體的分子機(jī)理有待下一步開(kāi)展深入研究。另外，N基因同源基因Np片段導(dǎo)入栽培煙草后，其是否也存在較大的連鎖累贅，是否也對(duì)烤煙產(chǎn)質(zhì)量有較大的影響，仍有待下一步開(kāi)展回交轉(zhuǎn)育后進(jìn)行比較分析。