荊文旭, 魏 磊, 萬(wàn) 雪, 石鑫鑫, 郭 明, 邢旭明, 史樹(shù)德

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 呼和浩特 010019)

amylase activity

種子活力是衡量種子品質(zhì)的重要指標(biāo)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中受諸多因素影響，種子貯藏時(shí)自然發(fā)生的老化便是其中之一。隨著自然老化時(shí)間的延長(zhǎng)，種子活力及抗逆性會(huì)出現(xiàn)不同程度的下降[1]，因此如何解決自然老化后種子活力下降的問(wèn)題至關(guān)重要。種子自然老化后，可通過(guò)人工輔助修復(fù)對(duì)其內(nèi)部進(jìn)行一系列結(jié)構(gòu)和功能的有效恢復(fù)，從而達(dá)到提高種子活力的目的[2]，由Heydecker等[3]首先提出的種子引發(fā)技術(shù)是有效方式之一。該方法利用引發(fā)劑對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)、內(nèi)含物含量、酶活性及代謝產(chǎn)生影響而提高種子活力及其抗逆性。在此階段植物細(xì)胞膜、細(xì)胞器和DNA都能得到充分修復(fù)，呼吸酶類得到充分活化[4]。引發(fā)處理后的種子播種后，會(huì)迅速越過(guò)萌動(dòng)階段，達(dá)到提高種子活力的目的。

甜菜(BetavulgarisL.)是內(nèi)蒙古地區(qū)特色經(jīng)濟(jì)作物之一，在內(nèi)蒙古區(qū)域經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)優(yōu)化調(diào)整以及中東部冷涼地區(qū)農(nóng)民脫貧致富中占有重要地位[5]。但當(dāng)前甜菜生產(chǎn)上種子嚴(yán)重依賴進(jìn)口，且不耐貯藏，一般進(jìn)口種子第二、三年萌發(fā)緩慢且抗逆性弱，種子活力較當(dāng)年下降30%～50%，常給企業(yè)和農(nóng)戶帶來(lái)較大的損失，不利于甜菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。種子引發(fā)技術(shù)可以不同程度提高作物和牧草[6]等種子活力、出苗整齊度、幼苗健壯程度以及植株抗逆性，但對(duì)于自然老化甜菜種子活力提高的方法研究則未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)以自然老化的甜菜種子為研究材料，研究經(jīng)不同引發(fā)劑的不同處理后種子活力和幼苗生理指標(biāo)的變化，以期篩選出提高老化甜菜種子活力的最佳引發(fā)劑種類及其處理濃度，為甜菜種質(zhì)資源保存、老化種子的再次利用及老化修復(fù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以自然條件下保存12年的法飼一號(hào)甜菜為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1引發(fā)處理

用不同引發(fā)劑處理老化甜菜種子，每種引發(fā)劑設(shè)置不同濃度，將室溫條件下浸種24 h后的老化甜菜種子，用蒸餾水沖洗數(shù)次后放置烘箱內(nèi)30 ℃烘干至原始重量備用。引發(fā)劑種類分別為H2O(T)、H2O2(H)、PEG-6000(P)、殼聚糖(CH)、CaCl2(Ca)、GA3(G)、AsA(A)，以未經(jīng)任何處理的自然老化甜菜種子為對(duì)照(ck),引發(fā)劑濃度與時(shí)間設(shè)置如表1所示。

表1 不同引發(fā)劑處理方式

1.2.2發(fā)芽指標(biāo)測(cè)定

將處理后的甜菜種子每30粒均勻擺放已提前放置好2層充分濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，3次重復(fù)，培養(yǎng)皿在人工氣候培養(yǎng)箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)至第7天時(shí)結(jié)束，注意培養(yǎng)皿中水分，防止因?yàn)樗诌^(guò)多或過(guò)少影響種子發(fā)芽。每隔24 h記錄發(fā)芽的種子數(shù)，結(jié)束培養(yǎng)時(shí)計(jì)算每個(gè)培養(yǎng)皿發(fā)芽幼苗的平均長(zhǎng)度，計(jì)算種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)，計(jì)算公式如下：

發(fā)芽勢(shì)(%)=(第3天正常發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子總粒數(shù))×100%[7]；

發(fā)芽率(%)=(第7天正常發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子總粒數(shù))×100%[8]；

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)，式中：Gt為當(dāng)天發(fā)芽數(shù)；Dt為發(fā)芽日數(shù)[8]；

活力指數(shù)=S×GI[8]，式中：S為幼苗平均長(zhǎng)度(mm)；GI為發(fā)芽指數(shù)；

平均發(fā)芽天數(shù)=∑(D×n)/∑n，式中:D為從種子置床起算的天數(shù)；n為相應(yīng)各天的發(fā)芽粒數(shù)。

1.2.3生理指標(biāo)測(cè)定

生理指標(biāo)測(cè)定分兩部分，一是將處理好的甜菜種子每9粒放置培養(yǎng)缽(d=10 cm)培養(yǎng)，基質(zhì)為甜菜育苗專用營(yíng)養(yǎng)土，每個(gè)處理3次重復(fù)，培養(yǎng)至第7天進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定。相對(duì)電導(dǎo)率采用電解質(zhì)外滲量法[9]測(cè)定；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[9]測(cè)定；可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[9]測(cè)定；超氧陰離子(O2·-)含量使用索萊寶試劑盒測(cè)定。二是結(jié)合種子活力指標(biāo)篩選出來(lái)每個(gè)試劑最佳處理，將其浸種過(guò)的種子放置培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)條件同發(fā)芽指標(biāo)測(cè)定相同，在萌發(fā)的第2天、第3天、第6天采用DNS法[9]進(jìn)行測(cè)定α-淀粉酶活力、β-淀粉酶活力。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制圖，采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同引發(fā)劑對(duì)老化甜菜種子活力的影響

由表2可知，引發(fā)劑種類及其濃度的不同，對(duì)老化甜菜種子的萌發(fā)指標(biāo)均有不同程度的影響。4種濃度的殼聚糖和GA3均能顯著(p<0.05)提高老化甜菜種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)，同時(shí)降低其平均發(fā)芽天數(shù)。純水處理中，以浸種12 h引發(fā)效果最好，發(fā)芽率較ck增加了100%；化學(xué)試劑處理中，分別以0.6% H2O2、25% PEG-6000、1.0%殼聚糖、1.5% CaCl2、250 mg·L-1GA3、100 mg·L-1AsA引發(fā)效果最好，發(fā)芽率較ck分別增加了130.06%、80.02%、520.07%、160.04%、330.06%、119.98%。平均發(fā)芽天數(shù)除H2O2和純水處理較ck無(wú)明顯下降外，其他各個(gè)處理的平均發(fā)芽天數(shù)均較ck顯著(p<0.05)減少。

表2 不同引發(fā)劑對(duì)老化甜菜種子活力的影響

由表3可知，將每種試劑最優(yōu)處理方式比較后發(fā)現(xiàn)，引發(fā)效果最好的處理是1.0%殼聚糖，其發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和活力指數(shù)較ck提高了916.19%、520.07%、877.27%，平均發(fā)芽天數(shù)減少了1.39 d，表明該處理可以顯著(p<0.05)提高種子活力，幼苗生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)。其次是250 mg·L-1GA3，在顯著(p<0.05)提高種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)以及活力指數(shù)的同時(shí)，也顯著(p<0.05)減少平均發(fā)芽天數(shù)。

表3 各試劑最優(yōu)處理對(duì)老化甜菜種子活力的影響

2.2 不同引發(fā)劑對(duì)甜菜生理指標(biāo)的影響

2.2.1不同引發(fā)劑對(duì)甜菜幼苗MDA含量、相對(duì)電導(dǎo)率、O2·-含量的影響

由表4可知，未引發(fā)處理直接播種的老化甜菜種子(ck)MDA含量、O2·-含量及其電導(dǎo)率值均為最大值，經(jīng)不同引發(fā)處理后的老化甜菜種子均得到了不同程度的下降，說(shuō)明引發(fā)對(duì)幼苗細(xì)胞膜系統(tǒng)有一定的修復(fù)作用。在不同時(shí)間純水處理中，以浸種12 h引發(fā)處理效果最好，在不同的化學(xué)試劑處理中，分別以0.6% H2O2、25% PEG-6000、1.0%殼聚糖、1.5% CaCl2、250 mg·L-1GA3、100 mg·L-1AsA對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)起到的修復(fù)效果最好。

表4 不同引發(fā)劑對(duì)甜菜幼苗MDA含量、相對(duì)電導(dǎo)率、O2·-含量的影響

由表5可知，每種試劑最優(yōu)處理對(duì)比發(fā)現(xiàn)，各個(gè)最優(yōu)處理較ck都起到了顯著(p<0.05)的引發(fā)效果，其中效果最好的是1.0%殼聚糖溶液，MDA含量較ck下降了75.10%，O2·-含量較ck下降了42.29%，電導(dǎo)率較ck下降了46.12%，其次是250 mg·L-1GA3，MDA含量較ck下降了69.95%，O2·-含量較ck下降了38.17%，電導(dǎo)率較ck下降了45.99%。電導(dǎo)率降低表明細(xì)胞膜系統(tǒng)傷害得到修復(fù)或提高了膜系統(tǒng)完整性。

表5 各試劑最優(yōu)處理對(duì)甜菜幼苗MDA含量、相對(duì)電導(dǎo)率、O2·-含量的影響

2.2.2不同引發(fā)劑對(duì)甜菜幼苗可溶性蛋白含量的影響

由圖1可知，經(jīng)不同引發(fā)處理后的幼苗可溶性蛋白含量較ck都有不同程度提高，且處理不同所呈現(xiàn)的效果也不同。其中，以250 mg·L-1GA3處理后可溶性蛋白含量最高，為16.43 mg·g-1，較ck增加了115.90%；其次是1.0%殼聚糖可溶性蛋白含量為14.54 mg·g-1，較ck增加了91.06%?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量的提高，表明種子經(jīng)過(guò)引發(fā)后，幼苗體內(nèi)參與各種代謝的酶類增加和滲透調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮作用，幼苗生長(zhǎng)潛力和抗逆性增強(qiáng)。

2.2.3不同引發(fā)劑對(duì)老化甜菜種子淀粉酶活力的影響

由圖2可知，α-淀粉酶活力總體呈上升的趨勢(shì)，經(jīng)不同引發(fā)劑處理后的α-淀粉酶活力較ck都有不同程度的提高，其中以250 mg·L-1GA3處理的活力最高，第6天酶活力較ck增加了155.37%，其次是1.0%殼聚糖，第6天α-淀粉酶活力較ck增加了115.30%，25% PEG-6000和12 h水浸種處理雖然對(duì)α-淀粉酶活力有提高的作用，但無(wú)論是增高幅度及酶活力大小都不如其他幾個(gè)處理顯著(p<0.05)。

由圖3可知，隨著萌發(fā)時(shí)間的增加，β-淀粉酶活力整體呈上升的趨勢(shì)，在第6天時(shí)，各處理酶活力均達(dá)到最大值。經(jīng)引發(fā)劑處理后的β-淀粉酶活力均高于ck，第6天12 h純水處理后的β-淀粉酶活力雖然顯著(p<0.05)高于其他處理，但與第2天及第3天的酶活力綜合分析后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)250 mg·L-1GA3處理后的活力最高，從第2天起活力均高于其他處理，其次是1.0%殼聚糖處理后的種子酶活力，這一結(jié)果與α-淀粉酶活力的變化趨勢(shì)相同，說(shuō)明這兩個(gè)處理對(duì)于老化甜菜種子淀粉酶活力的提高起到了良好的促進(jìn)作用。其他處理如100 mg·L-1AsA以及1.5% CaCl2對(duì)種子的淀粉酶活力的作用雖不如上述二者顯著(p<0.05)但也能使其活力得到較為明顯的提高。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同引發(fā)劑和濃度的處理，在提高促進(jìn)種子萌發(fā)的淀粉酶活力方面差異顯著，可指導(dǎo)開(kāi)發(fā)生產(chǎn)上應(yīng)用的自然老化甜菜種子引發(fā)技術(shù)，并且2種淀粉酶活力可作為種子是否被有效引發(fā)的指標(biāo)。

3 討 論

甜菜種子收獲后隨著貯藏時(shí)間的增加會(huì)出現(xiàn)種子老化，帶來(lái)的影響反映在種子活力及后續(xù)的生理生化特征中[10]。沙紅等[11]研究表明，人工加速老化的甜菜種子經(jīng)不同處理引發(fā)后，種子活力能得到不同程度的提高，說(shuō)明引發(fā)對(duì)人工老化甜菜種子能夠起到一定的修復(fù)作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，自然老化甜菜種子經(jīng)不同引發(fā)劑處理后，同樣可以提高種子活力及其抗逆性。

3.1 甜菜種子自然老化的生理機(jī)制

在種子貯藏過(guò)程中，活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的產(chǎn)生是導(dǎo)致種子老化的主要原因，其中O2·-是ROS中起主要作用的物質(zhì)。在種子萌發(fā)過(guò)程中，O2·-含量的增加會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化從而產(chǎn)生MDA，最終造成細(xì)胞膜透性增大，使相對(duì)電導(dǎo)率上升[12]。本研究表明，通過(guò)引發(fā)可以在一定程度上減少O2·-的產(chǎn)生，從而使MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率下降，最終使甜菜幼苗抗逆性增加。不同引發(fā)處理中，殼聚糖和GA3對(duì)O2·-含量、MDA含量及相對(duì)電導(dǎo)率降低效果顯著(表4)，對(duì)細(xì)胞膜透性能起到一定的修復(fù)作用。

可溶性蛋白可以通過(guò)維持細(xì)胞膨脹或滲透平衡穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)，可溶性蛋白的增加對(duì)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用，提高植物的抗逆性[12]。郭坤元等[13]研究表明，以低濃度外源硒作為引發(fā)劑可在一定程度上提高黃精種子可溶性蛋白的含量。本研究發(fā)現(xiàn)，以GA3作為引發(fā)劑處理后的幼苗可溶性蛋白含量明顯高于其他處理(圖1)，原因可能是外源GA3能緩解細(xì)胞中過(guò)氧化作用造成的溶酶體破壞，降低了貯藏物質(zhì)的降解速度[14]。其次殼聚糖處理也能明顯提高可溶性蛋白含量(圖1)，一定程度上緩解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解，進(jìn)而提高抗逆性。

α-淀粉酶與β-淀粉酶是種子貯藏過(guò)程中重要的淀粉水解酶，能促進(jìn)麥芽糖的產(chǎn)生，從而為種子的萌發(fā)提供能量[15]。二者對(duì)種子萌發(fā)過(guò)程能量的供給起著重要的調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)各試劑中最優(yōu)處理的淀粉酶活性進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，GA3處理后α-淀粉酶活性明顯高于對(duì)照(圖2)，β-淀粉酶活性低于12 h水處理但高于其他試劑處理(圖3)，說(shuō)明GA3能誘導(dǎo)植物體內(nèi)某些水解酶的產(chǎn)生，促進(jìn)淀粉水解，從而為種子萌發(fā)提供能源物質(zhì)[16]。但是12 h水處理β-淀粉酶顯著高于其他處理，這需要后續(xù)進(jìn)行更深入的研究分析。其次是殼聚糖處理后，α-淀粉酶及β-淀粉酶活性較ck均顯著上升(p<0.05)。

3.2 種子響應(yīng)引發(fā)處理的機(jī)制存在物種間差異

殼聚糖作為種子引發(fā)劑有廣泛的應(yīng)用[17]，可以為種子萌發(fā)過(guò)程中提供外界物質(zhì)進(jìn)入種子內(nèi)部的介質(zhì)與通道，從而為提高出苗率、抗逆性、增產(chǎn)等打下良好基礎(chǔ)。孟顯麗等[18]研究表明，殼聚糖對(duì)黃豆、紅小豆、豇豆、小麥種子萌芽和幼苗均有一定的促生長(zhǎng)作用。本試驗(yàn)研究結(jié)果與孟顯麗結(jié)果大致相同，隨著殼聚糖濃度的增加，引發(fā)效果呈先上升后下降的趨勢(shì)，1.0%殼聚糖溶液明顯提高自然老化甜菜種子活力及相關(guān)蛋白酶活性，修復(fù)膜系統(tǒng)損傷，增強(qiáng)幼苗抗逆性，減少老化對(duì)種子造成的損傷。

GA3具有解除休眠、促進(jìn)種子萌發(fā)的作用，能促進(jìn)植物莖、葉的生長(zhǎng)[19]，微量GA3作為引發(fā)劑有提高種子活力的作用[20]。丁憶然等[21]研究表明，適宜濃度的GA3溶液對(duì)人工老化的小麥種子活力及抗逆性有一定的修復(fù)作用。本研究結(jié)果與其結(jié)果大致相同，不同濃度的GA3溶液，對(duì)老化甜菜種子引發(fā)效果也不同。與ck相比，可溶性蛋白含量與淀粉酶的含量在所有處理中最高，這可能與GA3能誘導(dǎo)植物體內(nèi)水解酶產(chǎn)生有關(guān)系。相關(guān)研究表明GA3對(duì)α-淀粉酶有明顯的提高作用[22]。

此外，本試驗(yàn)使用的不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或化學(xué)試劑在其他種類作物上有顯著作用[23-28]，用其處理自然老化甜菜種子后，結(jié)果不盡相同。表明不同引發(fā)劑作用機(jī)理以及不同作物種子對(duì)引發(fā)的響應(yīng)過(guò)程存在差異，還需要進(jìn)一步深入分析，為引發(fā)劑在實(shí)踐中更加精準(zhǔn)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)研究了不同試劑的不同濃度以及不同時(shí)間純水浸種引發(fā)處理對(duì)自然老化甜菜種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響，探討了不同處理與老化種子的萌發(fā)動(dòng)態(tài)及生理特性的關(guān)系，結(jié)果表明，引發(fā)處理可在一定程度上修復(fù)自然老化甜菜種子的種子活力，同時(shí)提高其抗逆性。不同試劑對(duì)自然老化甜菜種子的提高效果不相同。以下處理為各試劑最優(yōu)處理：12 h純水引發(fā)、0.6% H2O2、25% PEG-6000、1.0%殼聚糖、1.5% CaCl2、250 mg·L-1GA3、100 mg·L-1AsA。綜合種子活力與幼苗生理生化特性能發(fā)現(xiàn)，在本試驗(yàn)中1.0%殼聚糖溶液對(duì)老化甜菜種子來(lái)說(shuō)，是效果最好的引發(fā)劑及引發(fā)濃度；其次，250 mg·L-1GA3對(duì)于老化甜菜種子活力修復(fù)也起到了明顯的效果。為甜菜種子加工和生產(chǎn)提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。