董亞兵， 何 方， 彭亞姝， 徐如宏， 錢小康， 任明見

(1.貴州大學農(nóng)學院/國家小麥改良中心貴州分中心， 貴陽 550025；2.遵義市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局， 貴州 遵義 563000)

紫色小麥是一類花青素在種皮中累積而表現(xiàn)出紫色、紫紅色、紫黑色等的小麥品種[1]。研究表明，花青素能夠抗氧化、抗衰老及抑制心腦血管疾病的發(fā)生[2-5]等。紫色小麥富含花青素，作為特殊種質(zhì)資源具有較大的開發(fā)和利用價值[6]。

紫粒小麥的種子因花青素的存在使種皮顏色呈現(xiàn)紫色[7]。種皮是由母體組織發(fā)育而來，所以母本基因型決定其紫粒色素，紫粒色素基因呈現(xiàn)母性遺傳且由細胞核基因控制[8]。國內(nèi)外對紫色小麥的紫粒性狀遺傳研究存在多種觀點，李楠楠[9]研究表明，紫粒性狀的遺傳受一對顯性基因或兩對顯性互補基因控制，并具有劑量效應。錢小康[10]、黃碧光[11]、孫群等[12]研究表明，紫粒性狀分別受兩對不完全顯性互補基因、重復基因、兩個相互獨立基因和三個基因控制。紫色小麥的紫粒性狀遺傳復雜性受遺傳背景和環(huán)境條件的影響。不同紫色小麥材料之間，紫粒性狀的遺傳特性具有較大的差異[13-15]。

通過全基因組水平上掃描并檢測與重要性狀相關的基因序列差異和結構變異可進行遺傳進化分析[16-17]，也可利用多態(tài)性差異開發(fā)新分子標記對重要性狀基因進行精細定位及候選基因預測[18]。集團分離分析法(Bulked Segregation Analysis，BSA)通過一對親本重組交換得到的分離群體中選取一定數(shù)量的植株，對目標基因的不同表型進行鑒別，形成兩個亞群體或群體[19]。將每組等量的DNA混合形成兩個相對性狀的基因庫，選擇合適的分子標記對兩個基因庫進行分析，將兩組之間顯示多態(tài)性的分子標記與目標性狀的基因進行連接[20-22]。孫磊[23]基于群體基因組重測序開發(fā)的SNP標記構建了高密度遺傳圖譜,并進行了葡萄果實顏色QTL定位,結合轉錄組測序從QTL定位區(qū)間篩選到多個候選基因,并對個別候選基因進行了初步功能驗證。曾偉偉[24]采用全基因組重測序技術開發(fā)分子標記，對小麥莖稈發(fā)育調(diào)控基因qd1進行精細定位和克隆，將小麥莖稈發(fā)育調(diào)控基因qd1定在4 B染色體上，其遺傳距離為0.29 cM。劉書林等[25]采用集團分離分析法(BSA)結合全基因組重測序結果開發(fā)新標記，將目的基因定位在4號染色體上。

貴紫麥1號是2015年通過貴州省農(nóng)作物品種審定委員會審定的紫粒小麥品種(黔審麥2015003)。本研究通過常規(guī)遺傳分析方法與全基因組重測序技術結合集團分離分析策略進行紫粒性狀的遺傳規(guī)律和基因定位研究，為紫色小麥紫粒性狀目的基因的克隆、遺傳轉化及功能驗證提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用材料貴紫麥1號(黔審麥2015003)(紫粒)、貴農(nóng)19號(黔審麥2007004)、貴農(nóng)麥30號(黔審麥2015002)，均由貴州大學農(nóng)學院國家小麥改良中心貴州分中心自主選育并提供。

1.2 遺傳群體構建

貴紫麥1號分別與白粒小麥品種貴農(nóng)19號、貴農(nóng)麥30號進行正反交獲得F1代。將收獲的F1代單株進行套袋自交獲得F2代群體，同時開展回交獲得BC1F1群體。并采用單籽粒傳法將F2代群體通過加代自交獲得F3、F4、F5代群體。于2021年3月分蘗后期對F5代單株進行掛牌編號，剪取葉片，采用CTAB法提取DNA置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 遺傳規(guī)律分析

利用色選機將F1、F2～F5及BC1F1各世代群體根據(jù)籽粒顏色進行區(qū)分和登記。統(tǒng)計F1、F2、F3、BC1F1群體各個組合紫粒和白粒的比例，分析紫?；虻倪z傳規(guī)律。

1.4 開發(fā)標記及群體驗證

根據(jù)F5代群體粒色深淺將群體劃分為極紫、深紫、中紫、淺紫、淺色、白色等6個等級。在貴紫麥1號和貴農(nóng)麥30號雜交組合中，從6個粒色類群中分別選取極紫和白色單株各30株，采用DNA基因組試劑盒提取DNA。將DNA進行等量混合構建紫、白兩個極端混池，將混池和雙親DNA提供給深圳華大基因股份有限公司進行全基因組重測序檢測。

基于重測序檢測結果共開發(fā)出517對InDel標記，分子標記全部由上海生物工程股份有限公司合成。將517對分子標記在混池及雙親中進行檢測，獲得特異性標記。利用特異性標記在定位研究群體中進行驗證。研究群體中的DNA提取參照彭琴等[26]等改良的CTAB法進行基因組提取。PCR反應體系見表1。

表1 10 μL PCR反應體系

PCR反應條件:94 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，退火溫度依引物設計而定，退火50 s，72 ℃延伸45 s，其中變性、退火、延伸3個步驟共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物采用10%的非變性聚丙烯凝膠電泳，通過銀染顯影后在白熾燈下進行拍照保存，統(tǒng)計擴增條帶。

2 結果與分析

2.1 世代群體紫粒性狀的表現(xiàn)

利用貴紫麥1號與貴農(nóng)19號、貴農(nóng)麥30號，通過組配正反交組合(貴紫麥1號×貴農(nóng)麥30號、貴農(nóng)麥30號×貴紫麥1號；貴紫麥1號×貴農(nóng)19號、貴農(nóng)19號×貴紫麥1號)以構建正反交F1、F2、F3和BC1F1代群體。分別對各世代群體籽粒的顏色性狀進行鑒定與統(tǒng)計(表2)。

表2 雜交后代群體籽粒顏色性狀的表現(xiàn)

由表2可知，F(xiàn)1代籽粒的顏色與母本相同，F(xiàn)2世代籽粒的顏色均表現(xiàn)為淺紫色，F(xiàn)3世代籽粒顏色發(fā)生分離。通過F1代與紫粒親本回交，后代籽粒顏色均為紫色；F1代與白粒親本回交，后代籽粒顏色發(fā)生分離現(xiàn)象。結果表明，貴紫麥1號的紫粒性狀由顯性基因控制。

2.2 貴紫麥1號與貴農(nóng)麥30號雜交后代群體籽粒顏色的分析

利用貴紫麥1號與白粒小麥貴農(nóng)麥30號進行正反交，鑒定并統(tǒng)計其正反交F3及回交群體的籽粒顏色。通過卡方檢驗分析紫粒與白粒的分離比例(表3)。

表3 貴紫麥1號與貴農(nóng)麥30號雜交后代群體籽粒顏色的分離情況

由表3可知，群體中紫粒與白粒的分離比例符合1∶3；F3群體中紫粒與白粒的分離比例符合9∶7。F1代與白粒親本回交，后代群體籽粒顏色發(fā)生分離現(xiàn)象，紫粒與白粒的分離比例均符合1∶3；F1代與紫粒親本回交，后代群體籽粒顏色均表現(xiàn)為紫色。正反交F3世代中紫粒與白粒的分離比例均符合9∶7，表明貴紫麥1號的紫粒性狀受兩對顯性互補基因控制。

2.3 貴紫麥1號與貴農(nóng)19號雜交后代群體籽粒顏色的分析

利用貴紫麥1號與貴農(nóng)19號進行正反交，鑒定并統(tǒng)計其正反交F3世代及回交群體的籽粒顏色。通過卡方檢驗分析紫粒與白粒的分離比例(表4)。

表4 貴紫麥1號與貴農(nóng)19號雜交后代群體籽粒顏色的分離情況

由表4可知，群體中紫粒與白粒的分離比例符合1∶3；F3群體中紫粒與白粒的分離比例符合9∶7。F1與白粒親本回交，后代群體籽粒顏色發(fā)生分離現(xiàn)象，紫粒與白粒的分離比例均符合1∶3；F1與紫粒親本回交，后代群體籽粒顏色均表現(xiàn)為紫色。正反交F3世代中紫粒與白粒的分離比例均符合9∶7，表明貴紫麥1號的紫粒性狀受兩對顯性互補基因控制。

2.4 紫粒性狀基因的遺傳模式

根據(jù)貴紫麥1號與白粒小麥(貴農(nóng)19號或貴農(nóng)麥30號)雜交后代群體籽粒顏色的分離情況分析，貴紫麥1號的紫粒性狀由兩對顯性的互補基因控制。當兩對顯性基因共同存在時，貴紫麥1號的籽粒顏色方表現(xiàn)為紫色，當僅有一對顯性基因或為雙純和隱性基因時，籽粒顏色為白色。假設紫粒小麥品種貴紫麥1號的基因型為AABB，白粒小麥品種貴農(nóng)麥30號和貴農(nóng)19號的基因型為aabb，其遺傳模式見圖1。

2.5 紫?；蚨ㄎ患叭后w驗證

2.5.1重測序結果分析

采用全基因組重測序技術分別對紫、白兩個混池及其親本進行全基因組檢測。經(jīng)數(shù)據(jù)處理分析表現(xiàn)差異的InDel共有123 086個，通過數(shù)據(jù)過濾處理發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)出差異的InDel共有16 465個，將表現(xiàn)出差異的InDel整合至21條染色體上(圖2)。大量差異InDel位點分布在2 A、6 A、1 B、2 B、3 B、5 B、6 B、7 B和7 D等9條染色體上，以上9條染色體中的InDel約占總InDel數(shù)量的67%。結果表明，貴紫麥1號的紫?；蚝芸赡艽嬖谟谶@9條染色體上。

為探究貴紫麥1號紫?；虼_切位置，需進一步分析這9條染色體上的InDel分布密度，再根據(jù)InDel的數(shù)量及密度判定貴紫麥1號紫?；虻乃谖恢?。基于重測序數(shù)據(jù)分析，染色體2 A和7 D中的InDel較于染色體6 A、1 B、2 B、3 B、5 B、6 B和7 B相對集中分布(圖3)，可初步判定貴紫麥1號的紫?；虼嬖谟? A和7 D染色體上，其物理區(qū)間分別為673～698 Mb和581～601 Mb。

2.5.2多態(tài)性標記篩選及群體驗證

將517對InDel標記在紫白混池和雙親中進行多態(tài)性檢測，在2 A和7 D兩條染色體共獲得多態(tài)性標記39對，其中2 A染色體包括chr 2 A 26、chr 2 A 25、chr 2 A 37、chr 2 A 28、chr 2 A 34、chr 2 A 32、chr 2 A 16、chr 2 A 20、chr 2 A 1、chr 2 A 2、chr 2 A 27、chr 2 A 38、PP 1、PP 2、2 A 5、2 A 8、2 A 296、DY-2 A 5、DY-2 A 6和DY-2 A 7等20對多態(tài)性標記；7 D染色體包括chr 7 D 5、chr 7 D 6、chr 7 D 15、chr 7 D 14、chr 7 D 19、chr 7 D 43、chr 7 D 25、chr 7 D 48、chr 7 D 20、chr 7 D 7、chr 7 D 12、chr 7 D 24、chr 7 D 35、chr 7 D 37、chr 7 D 33、DY-7 D 1、DY-7 D 6、DY-7 D 8和DY-7 D 10等19對多態(tài)性標記。

利用JoinMap 4.0軟件對分離群體的紫粒性狀和分子標記的分離數(shù)據(jù)進行連鎖計算，獲取其遺傳距離。遺傳連鎖圖譜采用MapChat 4.0軟件進行繪制。結果表明，控制貴紫麥1號紫粒性狀的一對顯性基因存在于2 AL和7 DL染色體上。2 A染色體中的紫粒基因GZMPp1與標記chr 2 A 32的遺傳距離為1.2 cM。7 D染色體上的紫?；騁ZMPp2與標記DY-7 D 6的遺傳距為0.5 cM。

2.6 候選基因功能注釋

根據(jù)基因定位結果，在定位區(qū)間內(nèi)進行候選基因查詢。對每個基因的分子功能進行鑒定。在2 AL染色體的定位區(qū)間內(nèi)共找到2個與花青素合成途徑相關的功能注釋基因，基因功能注釋為bHLH protein。在7 DL染色體定位區(qū)間內(nèi)共找到5個與花青素合成途徑相關的功能注釋基因，基因功能注釋為MYB-related transcription factor。運用NCBI網(wǎng)站將兩條染色體上的7條候選基因進行查詢均與花青素合成代謝相關。

表5 貴紫麥1號定位區(qū)間內(nèi)候選基因功能注釋

3 討 論

本研究以貴紫麥1號(紫粒)分別與貴農(nóng)19號和貴農(nóng)麥30號(白粒)進行正反交及回交。通過對籽粒顏色統(tǒng)計，以紫粒小麥為母本與白粒小麥雜交，其F1世代籽粒顏色為紫色；以白粒小麥為母本與紫粒小麥雜交，其F1世代籽粒的顏色為白色，因此，F(xiàn)1世代籽粒的顏色始終與母本一致。F2世代籽粒的顏色均為淺紫色。結果表明，貴紫麥1號的紫粒性狀在種皮中表現(xiàn)，種皮是由珠被發(fā)育而來。因此，種皮顏色的表達由上一代植株的基因型控制且紫粒性狀表現(xiàn)為顯性。關于紫色小麥的紫粒性狀遺傳規(guī)律國內(nèi)很早便展開了研究，歐俊梅等[27]在紫粒小麥漯珍1號的研究中，經(jīng)過卡方測驗，F(xiàn)2群體中紫粒與白粒的分離比例符合9∶7，而F1代與白粒親本回交后紫粒與白粒的分離比為1∶3，結果表明，漯珍1號品種的紫粒性狀是由兩個完全顯性的基因共同決定。徐丙元[28]在紫粒小麥漯珍1號的研究中發(fā)現(xiàn)，漯珍1號的紫粒性狀同樣由兩個完全顯性的基因獨立決定。針對貴紫麥1號在F3代中籽粒顏色發(fā)生分離現(xiàn)象研究中，結果表明，貴紫麥1號的紫粒性狀由兩對顯性互補基因控制，當兩個顯性基因共同存在時，貴紫麥1號的籽粒顏色表現(xiàn)為紫色，當只有一個顯性基因或純隱形基因時，籽粒顏色為白色。表明，兩顯性基因間存在相互作用的結果。不同來源的紫粒小麥研究結果與本研究結果一致[29]。也有研究表明，不同來源的紫粒小麥的紫粒性狀是由一個完全顯性基因決定的[30-31]。畢嬋，尤明山[17]在紫粒小麥的研究中發(fā)現(xiàn)，紫麥農(nóng)大3753的籽粒顏色為顯性單基因控制，且將紫?；蚨ㄎ辉? D染色體上[32]。綜上表明，其原因極有可能是不同生長環(huán)境的影響，紫粒小麥種皮中花色素的合成不僅受遺傳物質(zhì)的控制，而且還會受到光照和溫度等環(huán)境因素的影響[33-35]。環(huán)境因素通過影響花青素的積累，從而影響紫粒小麥紫粒顏色的表型，干擾了研究者對紫粒性狀的觀察統(tǒng)計，從而導致不同的研究結果[36]。

基于全基因組重測序及特異性標記檢測結果，將控制貴紫麥1號紫粒性狀的兩個互補顯性基因分別位于2 AL和7 DL染色體上。根據(jù)基因定位結果，在2 AL和7 DL染色體定位區(qū)間內(nèi)共找到7個與花青素合成途徑相關的功能注釋基因[37-38]，基因功能注釋為bHLH protein和MYB-related transcription factor[39]。王偉偉等[40]、葉廣繼等[41]研究發(fā)現(xiàn)，bHLH和MYB轉錄因子均可調(diào)控花青素的合成代謝。經(jīng)過NCBI查詢7個候選基因位置與重測序候選物理區(qū)間重疊，表明控制貴紫麥1號紫?；蛟谶@7個候選基因內(nèi)。