馮 娜， 李景環(huán)

(內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 呼和浩特 010020)

野大麥(HordeumbrevisubulatumL.)為禾本科大麥屬的多年生草本植物[1]，在我國，分布于東北、內(nèi)蒙古、陜西北部、寧夏、甘肅、青海、新疆、西藏等省區(qū)[2]。野大麥適口性好、適應(yīng)性廣且具有較強(qiáng)的耐鹽性，營養(yǎng)豐富，粗蛋白含量高，是優(yōu)良飼草。此外，野大麥有較強(qiáng)的耐鹽堿、耐寒、抗病蟲害等能力，是禾本科小麥族耐鹽性最強(qiáng)的鹽生植物之一[3-4]，可用于改良鹽堿地，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和飼用價(jià)值。一直以來小麥和牧草育種學(xué)家選擇野大麥作為優(yōu)良的基因資源，對(duì)小麥和飼草進(jìn)行改良，育成了具有耐鹽堿的新品種。雜交育種離不開細(xì)胞遺傳學(xué)的指導(dǎo)，染色體的核型分析就是一種細(xì)胞遺傳學(xué)分析方法。

染色體核型又稱染色體組型，核型分析是對(duì)細(xì)胞有絲分裂中期染色體的各種特征進(jìn)行定性和定量表述的一種分析方法，包括染色體數(shù)目、染色體形態(tài)、染色體分子特征等[5]。染色體核型分析廣泛應(yīng)用在物種系統(tǒng)分類、起源與鑒定、親緣關(guān)系分析等方面，而高質(zhì)量的染色體制片和染色體上清晰可辨的標(biāo)識(shí)是準(zhǔn)確進(jìn)行核型分析的保障[6]。

熒光原位雜交技術(shù)可以為核型分析提供清晰的標(biāo)識(shí)，該技術(shù)是將熒光素標(biāo)記的探針代替同位素標(biāo)記與待測(cè)樣品中的待測(cè)序列以堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合在一起，常用的標(biāo)記物有生物素標(biāo)記、地高辛標(biāo)記等。目前，熒光原位雜交技術(shù)已經(jīng)成為一種非常重要的原位雜交技術(shù)[7]，憑著其特征顯著、分辨率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、操作安全便捷等特點(diǎn)，已經(jīng)應(yīng)用于產(chǎn)前診斷[8-9]、唐氏綜合征、膀胱癌等[10-11]臨床醫(yī)學(xué)，以及染色體結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)和標(biāo)記基因定位[12]等生物學(xué)領(lǐng)域，在細(xì)胞遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等方面也有較高的研究?jī)r(jià)值。在高等真核生物中，45 SrDNA是高度保守的序列，是編碼rRNA的基因[13]。45 SrDNA在核仁組織區(qū)上[14]，一般位于隨體染色體的核仁組織區(qū)[15]，5 SrDNA是編碼5 SrRNA的基因。重復(fù)序列pAs 1和pSc 119.2在小麥族植物染色體中廣泛存在，是微衛(wèi)星序列。45 SrDNA、5 SrDNA、pAs 1和pSc 119.2序列是植物染色體原位雜交實(shí)驗(yàn)中常用的探針序列[16-18]。

以野大麥為試驗(yàn)材料，采用45 SrDNA、5 SrDNA、pAs 1和pSc 119.2這4種序列制備的探針，與野大麥的根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體進(jìn)行熒光原位雜交并分析，構(gòu)建核型，確立各個(gè)標(biāo)記信號(hào)在染色體上的分布特點(diǎn),以期為野大麥的系統(tǒng)研究和雜交育種提供理論參考，同時(shí)為大麥屬植物以及小麥族近緣種植物的分類學(xué)和細(xì)胞學(xué)等研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)使用的野大麥種子由內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院李景環(huán)老師提供。

1.2 方 法

1.2.1野大麥體細(xì)胞染色體標(biāo)本制備

選取野大麥飽滿充實(shí)的種子放入墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，放于最適溫度為25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待根部長(zhǎng)到1.5 cm左右時(shí)，于上午剪取根尖作為試驗(yàn)材料。冰水混合物進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理結(jié)束后用蒸餾水洗凈，置于卡諾固定液固定8 h， 2%的纖維素酶進(jìn)行解離，改良石炭酸品紅染液染色1 h。之后壓片和鏡檢，選取染色體清晰可見的裝片，冰凍揭片，梯度乙醇脫水，備用。

1.2.2探針標(biāo)記

堿裂解法分別提取攜帶45 SrDNA、5 SrDNA、pAs 1 DNA和 pSc 119.2 DNA的質(zhì)粒DNA，采用DNA缺口平移法，用地高辛-dUTP標(biāo)記5 SrDNA探針和pAs 1 DNA探針，生物素標(biāo)記45 SrDNA和pSc 119.2 DNA探針。4種探針由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.2.3熒光原位雜交

利用45 SrDNA、5 SrDNA、pAs 1 DNA和pSc 119.2 DNA探針與野大麥的根尖中期染色體進(jìn)行原位雜交，原位雜交具體步驟參照李景環(huán)等[19]的方法，用Olympus BX 51熒光顯微鏡觀察并拍照保存。

1.2.4核型分析

對(duì)獲得的圖片和數(shù)據(jù)等進(jìn)行處理，選擇30個(gè)以上染色體分散良好的中期分裂相細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，85%的細(xì)胞中染色體數(shù)目一致，則該數(shù)目確定為該物種的染色體數(shù)。選擇染色體分散清晰的5個(gè)細(xì)胞的分裂相進(jìn)行核型參數(shù)的測(cè)量和計(jì)算，測(cè)量染色體長(zhǎng)臂值和短臂值，并計(jì)算染色體的相對(duì)長(zhǎng)度和臂比，最后取5個(gè)細(xì)胞的各項(xiàng)參數(shù)平均值作為核型分析的參數(shù)。同時(shí)結(jié)合熒光原位雜交獲得的標(biāo)記信號(hào)，對(duì)染色體進(jìn)行同源配對(duì)，構(gòu)建核型分析圖和核型公式，核型分析的方法一般參照李懋學(xué)和陳瑞陽[20]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，以Levan等[21]的公式計(jì)算相對(duì)長(zhǎng)度，核型分類采用Stebbins[22]的分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

采用染色體分析軟件Karyo 3.1進(jìn)行長(zhǎng)度測(cè)量，繪制染色體核型圖。利用Excel軟件計(jì)算相對(duì)長(zhǎng)度等參數(shù)，并作出核型參數(shù)表。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)目分析

根據(jù)染色體核型分析標(biāo)準(zhǔn)，85%以上的細(xì)胞具有的染色體數(shù)目確定為是該物種的染色體數(shù)目[20]。在本實(shí)驗(yàn)中，選擇30個(gè)中期分裂相細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)得出，野大麥根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為2 n=28，如圖1和圖2。

2.2 熒光原位雜交標(biāo)記信號(hào)分析

選取5個(gè)染色體分散清晰的細(xì)胞，用Olympus BX 51進(jìn)行圖片采集，再用Karyo 3.1軟件進(jìn)行長(zhǎng)度測(cè)量，計(jì)算核型參數(shù)，同時(shí)結(jié)合四種探針的熒光原位雜交標(biāo)記信號(hào)的特征，進(jìn)行同源染色體配對(duì)，得到野大麥根尖細(xì)胞染色體原位雜交圖和染色體核型圖，見圖1和圖2。

由圖1和圖2可知，野大麥的染色體數(shù)目為2 n=28條。45 SrDNA的數(shù)目與具有隨體的染色體數(shù)相同[23]，因此野大麥有6對(duì)具有隨體的染色體，分別位于第6號(hào)、第10號(hào)、第11號(hào)、第12號(hào)、第13號(hào)和第14號(hào)染色體的短臂上。

通過觀察圖1和圖2可以看到，在Olympus BX 51熒光顯微鏡采集的圖片中，用地高辛-dUTP標(biāo)記的5 SrDNA探針和pAs 1 DNA探針顏色為紅色；生物素標(biāo)記的45 SrDNA和pSc 119.2 DNA探針顏色為綠色。45 SrDNA和5 SrDNA探針同時(shí)與野大麥根尖中期染色體進(jìn)行原位雜交，如圖1；pAs 1 DNA和pSc 119.2 DNA探針同時(shí)與野大麥染色體進(jìn)行雜交，如圖2；DAPI復(fù)染后的染色體呈現(xiàn)為藍(lán)色。由圖1可以看到，5 SrDNA位于第10號(hào)和第14號(hào)染色體的短臂上；45 SrDNA定位在6對(duì)染色體上，分別定位于第6號(hào)、第10號(hào)、第11號(hào)、第14號(hào)染色體的短臂上，信號(hào)較強(qiáng)，第12號(hào)、第13號(hào)染色體上的45 SrDNA位于近著絲粒的位置上，但是第12號(hào)染色體上的45 SrDNA熒光信號(hào)強(qiáng)，而第13號(hào)染色體上的45 SrDNA熒光信號(hào)較弱；第10號(hào)和第14號(hào)染色體上同時(shí)出現(xiàn)了45 SrDNA和5 SrDNA的雙色雜交信號(hào)。pAs 1 DNA的熒光信號(hào)出現(xiàn)在所有的染色體上，大部分位于染色體的端部，第7號(hào)和第9號(hào)染色體的pAs 1 DNA則位于中部且信號(hào)較弱； pSc 119.2 DNA分布于第7號(hào)、第10號(hào)和第14號(hào)共3對(duì)染色體上，且都位于染色體短臂的末端，但信號(hào)強(qiáng)弱不同，在第7號(hào)染色體上pSc 119.2 DNA信號(hào)較強(qiáng)，第10號(hào)染色體的一條染色體的短臂末端信號(hào)較強(qiáng)，但是另一條染色體沒有出現(xiàn)熒光信號(hào)，第14號(hào)染色體的pSc 119.2 DNA信號(hào)較弱；pAs 1 DNA和pSc 119.2 DNA雙色雜交位點(diǎn)出現(xiàn)在第7號(hào)、第10號(hào)和第14號(hào)染色體上。

2.3 染色體核型參數(shù)

核型參數(shù)可以反映一個(gè)物種的進(jìn)化程度，核型是由對(duì)稱向不對(duì)稱發(fā)展[22]。野大麥核型參數(shù)的計(jì)算，是通過Karyo 3.1軟件對(duì)染色體的長(zhǎng)臂、短臂進(jìn)行測(cè)量，然后用Excel軟件計(jì)算染色體相對(duì)長(zhǎng)度和臂比，根據(jù)臂比確定染色體的著絲粒類型。野大麥中期染色體的核型參數(shù)見表1。

表1 野大麥染色體核型參數(shù)

由表1可以看出，野大麥的根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為2 n=28，染色體組總長(zhǎng)度為92.269 μm，平均絕對(duì)長(zhǎng)度為6.591 μm，染色體的絕對(duì)長(zhǎng)度變化范圍為7.581～5.486 μm，染色體的相對(duì)長(zhǎng)度變化范圍為8.216%～5.946%，最長(zhǎng)染色體與最短染色體長(zhǎng)度比值為1.382；臂比最大值為1.628，最小值為1.079，根據(jù)著絲粒位置來分，野大麥的染色體都為m型(中部著絲粒)，沒有出現(xiàn)臂比值大于2的染色體，核型類型屬于1 A型(最對(duì)稱的核型)，核型不對(duì)稱系數(shù)為57.227%。核型公式為2 n=4 x=28=28 m(12 SAT)。

3 討 論

3.1 熒光原位雜交

熒光原位雜交技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以在同一個(gè)染色體片上顯示出不同的DNA探針的定位，被廣泛應(yīng)用于各種染色體檢測(cè)、定位研究中[24]。在試驗(yàn)過程中，最為重要的就是特異性探針序列的選擇[24]，本研究選擇小麥族的45 SrDNA序列、5 SrDNA序列、高度重復(fù)序列pAs 1 DNA和pSc 119.2作為探針，這些探針常用來分析小麥族物種的親緣關(guān)系和進(jìn)化[23-26]。

孔芳等[23]認(rèn)為，45 SrDNA 的數(shù)目與具有隨體的染色體數(shù)相同，在染色體的次縊痕處，以此確定野大麥有6對(duì)染色體有隨體。Mantovani等[27]認(rèn)為，5 SrDNA原位雜交位點(diǎn)數(shù)目以一對(duì)或兩對(duì)為主，但在染色體上沒有穩(wěn)定不變的分布位置，這與本研究5 SrDNA的定位結(jié)果基本一致。rDNA是進(jìn)化上高度保守的序列，尤其是在同一物種的同源染色體上的位置和拷貝數(shù)基本相同，這為核型分析進(jìn)行染色體的配對(duì)提供了清晰可見的標(biāo)識(shí)，利于準(zhǔn)確配對(duì)。但是在同屬不同物種中rDNA的位置和拷貝數(shù)會(huì)有所不同，這可以用于物種的分類和演化研究[23]。

pAs 1 DNA序列和的pSc 119.2 DNA在遺傳上也是相對(duì)保守的，尤其體現(xiàn)在分布位置上。pAs 1 DNA一般集中分布在端部和著絲粒處，對(duì)于近緣物種而言都位于大致相同的位置，但是在不同的物種中會(huì)表現(xiàn)出不同的拷貝數(shù)；本實(shí)驗(yàn)顯示pSc 119.2 DNA分布于野大麥部分染色體的末端，且信號(hào)較強(qiáng)。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，pAs 1 DNA和pSc 119.2 DNA可以作為一種熒光標(biāo)記來進(jìn)行染色體同源配對(duì)。

有了明顯的熒光標(biāo)記可以推斷染色體的進(jìn)化，本實(shí)驗(yàn)中10號(hào)染色體出現(xiàn)了一條沒有標(biāo)記pSc 119.2信號(hào)的結(jié)果，再結(jié)合45 SrDNA和5 SrDNA的標(biāo)記結(jié)果配對(duì)，推測(cè)10號(hào)染色體可能是發(fā)生了染色體頂端的缺失。

3.2 野大麥核型

染色體核型分析對(duì)植物的系統(tǒng)分類、物種的遺傳進(jìn)化提供了基礎(chǔ)[28]。丁鴻等[29]在2012年發(fā)表了植物染色體標(biāo)本的制備和染色體核型分析研究進(jìn)展，認(rèn)為核型分析技術(shù)是細(xì)胞遺傳學(xué)中最基本最常用的方法，在植物分類、起源、演化等方面都有重大意義，也為以后核型分析的發(fā)展做出了展望。本研究根據(jù)檢測(cè)到的45 SrDNA和5 SrDNA熒光原位雜交信號(hào)的數(shù)量、強(qiáng)弱和位置等，成功將野大麥6對(duì)染色體配對(duì)，提高了染色體配對(duì)的精確性，為野大麥染色體核型模型的建立提供了支持。pAs 1 DNA序列和pSc 119.2 DNA也為核型分析提供了明顯的可視標(biāo)記。由此可見，熒光原位雜交技術(shù)使常規(guī)的染色體核型分析更為便捷準(zhǔn)確。

有關(guān)野大麥染色體核型的研究于立華等[30]得到的核型公式為2 n=4 x=28=22 m(4 SAT)+6 sm(2 SAT)，本研究結(jié)果為2 n=4 x=28=28 m(12 SAT)。兩種結(jié)果除了染色體數(shù)目相同外，其他的核型特征相差很大。表現(xiàn)在具隨體的染色體、著絲粒類型、染色體的對(duì)稱類型。于立華的結(jié)果為6條染色體具隨體，本研究具隨體的染色體為12條，隨體的分布除了與物種本身特征有關(guān)外，與制片的方法以及染色體識(shí)別的方法也有直接關(guān)系。常規(guī)染色體制圖得到的染色體圖片，如果隨體特別小，就很難識(shí)別；孔芳等[23]認(rèn)為，45 SrDNA的數(shù)目與具有隨體的染色體數(shù)相同，所以帶有45 SrDNA探針標(biāo)記的染色體容易識(shí)別，本研究的隨體就是結(jié)合45 SrDNA探針進(jìn)行判斷的。關(guān)于染色體的著絲粒類型，于立華的研究結(jié)果是11對(duì)中著絲粒染色體，3對(duì)近中著絲粒染色體，本研究的結(jié)果都是中部著絲粒染色體，對(duì)于著絲粒的判斷，如果僅靠染色體形狀判斷一定會(huì)有誤差，最好的辦法是采用著絲粒處序列的熒光標(biāo)記，本研究和于立華的著絲粒判別都是根據(jù)主縊痕的凹陷進(jìn)行判斷的，會(huì)存在一定的誤差，因此結(jié)果不一致。根據(jù)Stebbins的核型分類標(biāo)準(zhǔn)將野大麥確定為1 A型，最對(duì)稱的核型，于立華的結(jié)果2 B類型，這個(gè)結(jié)果主要依賴于染色體長(zhǎng)度測(cè)量的準(zhǔn)確性和配對(duì)的準(zhǔn)確性，當(dāng)然造成差異的原因有很多，首先可能是操作手法和處理方法、使用試劑上會(huì)有不同導(dǎo)致結(jié)果的不同，對(duì)數(shù)據(jù)的處理也有不同。因此要想更準(zhǔn)確的進(jìn)行核型分析，要保證染色體的特征明晰，測(cè)量方法誤差小，可識(shí)別的熒光標(biāo)記種類適當(dāng)并且容易辨別，要想更準(zhǔn)確地進(jìn)行核型分析，還應(yīng)該進(jìn)行更多標(biāo)識(shí)的探針雜交。

4 結(jié) 論

5 SrDNA位于第10號(hào)和第14號(hào)染色體的短臂上；45 SrDNA位于第6號(hào)、第10號(hào)、第11號(hào)、第12號(hào)、第13號(hào)和第14號(hào)染色體的短臂上；pAs 1 DNA的熒光信號(hào)出現(xiàn)在大部分染色體的端部和部分在著絲粒區(qū)域；pSc 119.2的熒光信號(hào)出現(xiàn)在第7號(hào)和第14號(hào)染色體短臂的頂端，第10號(hào)染色體一條短臂的頂端，另一條染色體可能頂端缺失導(dǎo)致沒有出現(xiàn)pSc 119.2熒光信號(hào)。

核型公式為2 n=4 x=28=28 m(12 SAT)，核型類型屬于1 A型，為最對(duì)稱的核型，核型不對(duì)稱系數(shù)為57.227%，在系統(tǒng)演化上為較原始的種類，進(jìn)化程度低。

適當(dāng)全面的熒光標(biāo)記種類使染色體核型分析更為準(zhǔn)確便捷。