鄒品力，廖 欣，肖劍文

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液科/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地/兒科學(xué)重慶市重點實驗室，重慶 400014)

KMT2A基因重排，既往也稱為混合系白血病(MLL)基因重排，在嬰兒急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)中十分常見，約占75%。KMT2A基因位于目前已發(fā)現(xiàn)的KMT2A基因重排已有超過120例[1]。盡管KMT2A基因重排的轉(zhuǎn)錄本的預(yù)后與其伴侶基因相關(guān)，但目前報道的絕大部分KMT2A重排陽性患兒預(yù)后較差[1-3]。既往臨床上檢測KMT2A基因重排主要通過熒光原位雜交技術(shù)(FISH)及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)，但僅可檢出常見的KMT2A重排方式，不能覆蓋罕見的KMT2A重排方式。目前國際上KMT2A-USP2已報道的例數(shù)不足30例，且絕大多數(shù)均以個案為報道[4-8]，國內(nèi)鮮見報道。本文通過報道1例KMT2A-USP2融合基因陽性ALL患兒，并復(fù)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)，探討KMT2A-USP2融合基因陽性ALL患兒的臨床特點及預(yù)后情況，探究二代測序技術(shù)在ALL患兒中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 患兒，男，8個月，病初因“皮膚瘀斑10 d，發(fā)熱半天余”入院，查體：輕度貧血貌，皮膚可見散在瘀斑，淋巴結(jié)不大，肝臟肋下劍突下2 cm觸及，脾肋下未及。輔助檢查：初診血常規(guī)：血紅蛋白94 g/L，血小板計數(shù) 31×109L-1，白細(xì)胞計數(shù) 175.87×109L-1，原始幼稚淋巴細(xì)胞比例73%。骨髓細(xì)胞學(xué)結(jié)果提示為ALL L1型(圖1)。通過流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)(FCM)檢出的免疫分型結(jié)果提示B淋系抗原CD19、cCD79a、CD34、CD38及HLA-DR陽性，考慮為Pro-B ALL。通過FCM檢測到微小殘留病(MRD)標(biāo)志，可用于MRD檢測。FISH檢測ETV6-RUNX1、BCR-ABL1、TCF3-PBX1、MYC及KMT2A斷裂探針示陰性，其操作方式參考文獻(xiàn)[9]。使用多重巢式RT-PCR技術(shù)檢測29種融合基因轉(zhuǎn)錄本[10]，結(jié)果示陰性。

A.骨髓涂片(瑞士染色)；B.細(xì)胞化學(xué)染色(POX染色)。

1.2方法

1.2.1全外顯子組測序 肝素抗凝管采集患兒骨髓液2 mL，并從患兒口腔黏膜及其父母外周血中采集對照樣本。使用DNA 提取試劑盒(QIAamp DNA Blood MiniKit，Qiagen)從患兒骨髓液中提取基因組 DNA，操作方案按照試劑盒說明書，通過捕獲試劑盒(Agilent SureSelect Human All Exon V6)進(jìn)行序列采集，純化后進(jìn)行序列擴(kuò)增。采用高通量測序儀(Illumina hiseq PE 150bp)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。最后使用高通量測序儀(Illumina HiSeq X10)進(jìn)行測序，測序模式選用PE150。利用Illumina pipeline軟件(1.3.4版)讀取原始測序數(shù)據(jù)，并參照dbSNP 數(shù)據(jù)庫、ClinVar數(shù)據(jù)庫、ESP6500數(shù)據(jù)庫、ExAc數(shù)據(jù)庫、HGMD數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫及Ensembl數(shù)據(jù)庫等進(jìn)行分析。利用GATK、LRT、Mutation Taster及SamTools軟件預(yù)測突變基因，并用測序工具(http://sift.icvi.org/)及Polyphen網(wǎng)站 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph) 對蛋白質(zhì)功能進(jìn)行預(yù)測。

1.2.2轉(zhuǎn)錄組測序 取1.5 mL新鮮骨髓液樣本，使用RNA提取試劑盒(QIAamp RNA Blood MiniKit，Qiagen，Cat.52304)進(jìn)行總RNA的提取，操作步驟參照該試劑盒說明書進(jìn)行。然后使用建庫試劑盒(KAPA mRNA HyperPrep Kit，KAPA/Roche，Cat.KK8581)進(jìn)行mRNA-seq建庫，最后使用高通量測序儀(Illumina HiSeq X10)進(jìn)行測序，測序模式選用PE150。用BWA軟件將測序片段與人類參考基因組(UCSC-hg19)進(jìn)行比較，去除重復(fù)序列，用Picard軟件分析下游數(shù)據(jù)。使用GATK軟件預(yù)測基因突變，使用Seeksv軟件預(yù)測融合基因。

1.2.3致病突變與融合基因分析 參考美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院(ACMG)、分子病理學(xué)協(xié)會(AMP)及美國病理學(xué)家學(xué)院(CAP)的指南[11]建議分析骨髓標(biāo)本中的致病基因突變和融合基因。通過參考文獻(xiàn)[11]和軟件分析將發(fā)現(xiàn)的變異分為以下幾類：致病性、可能致病性、不確定意義、可能良性和良性。將致病基因型和可能致病基因型記錄為致病基因突變。檢出的致病基因突變，使用Sanger法驗證其PCR產(chǎn)物，同時交叉檢測其對照樣本。檢出的融合基因，通過設(shè)計引物，使用RT-PCR進(jìn)行驗證。

1.2.4治療方法 確診后該患兒在St Jude Total XV ALL方案基礎(chǔ)上采用改良的CCCG-ALL-2015方案進(jìn)行化療。因患兒年齡<1歲，初診白細(xì)胞>50%，初步評估為中危組。

2 結(jié) 果

盡管通過FISH提示KMT2A斷裂探針陰性且RT-PCR技術(shù)檢測到常見的KMT2A重排陰性，但因其為嬰兒，同時誘導(dǎo)緩解治療反應(yīng)差，故仍懷疑其存在KMT2A基因重排。WES檢測(圖2)出ATM、CASC5、LPP(來源于母親)和PDGFRB(來源于父親)的致病基因突變，并通過Sanger測序法證實。RNAseq檢測出USP2-NARS2、KMT2A-USP2和c15orf57-CBX3的融合轉(zhuǎn)錄物。通過設(shè)計Sanger測序和RT-PCR的特異性引物，排除了C15orf57-CBX3的融合轉(zhuǎn)錄本和KMT2A-USP2-NARS2的可疑融合轉(zhuǎn)錄本，證實了USP2-NARS2和KMT2A-USP2的融合轉(zhuǎn)錄本(圖3、4)。在USP2-NARS2融合中，5′端USP2基因的2號內(nèi)含子與3′端NARS2基因的2號外顯子融合，5′端USP2基因的2號外顯子也與3′端NARS2基因的2號外顯子融合。在KMT2A-USP2融合中，5′端KMT2A基因的22號外顯子與3′端USP2基因的3號外顯子融合。

1.分子量標(biāo)記物；2.融合轉(zhuǎn)錄本USP2-NARS2；3.融合轉(zhuǎn)錄本KMT2A-USP2；4.PCR質(zhì)控。

確診后患兒予以CCCG-ALL-2015方案中危組化療，誘導(dǎo)緩解第19天(D19)骨髓細(xì)胞學(xué)：增生極度降低，幼稚淋巴細(xì)胞占1%；骨髓MRD占14.87%。D50骨髓細(xì)胞學(xué)：原始幼稚淋巴細(xì)胞占15%；骨髓MRD占0.49%。CAT2前骨髓細(xì)胞學(xué)：幼稚淋巴細(xì)胞占8.5%；骨髓MRD占0.35%。因患兒D50及CAT2前骨髓細(xì)胞學(xué)持續(xù)處于M2狀態(tài)，MRD未緩解，調(diào)整危險度為高危。2019年1月10日間期前復(fù)查骨髓細(xì)胞學(xué)：原始幼稚淋巴細(xì)胞占10%；骨髓MRD<0.01%。2019年5月8日再誘導(dǎo)前復(fù)查骨髓細(xì)胞學(xué)：幼稚淋巴細(xì)胞占3%；骨髓MRD<0.01%。2019年5月23日再誘導(dǎo)期間復(fù)查骨髓細(xì)胞學(xué)：原始幼稚淋巴細(xì)胞占15%。2019年6月8日維持治療前復(fù)查骨髓細(xì)胞學(xué)：幼稚淋巴細(xì)胞占4.5%；骨髓MRD<0.01%。最近1次于2020年6月17日維持期復(fù)查骨髓細(xì)胞學(xué)：幼稚淋巴細(xì)胞占3%。目前該患兒已完成DEX+VDLP、CAT、CAT2、第1～4次HD-MTX鞏固、間期1～16周期化療再誘導(dǎo)、維持治療(一)1～5循環(huán)、維持治療(二)1～7循環(huán)，現(xiàn)維持治療(三)階段；期間按計劃行腰穿及鞘注，腦脊液檢查均無中樞浸潤依據(jù)?；熎陂g因反應(yīng)差考慮行異基因造血干細(xì)胞移植，但未找到合適供者，遂被擱置。截至隨訪時間，患兒已獲得完全緩解(CR)共25個月。

A.致病突變ATM；B.致病突變CASC5；C.致病突變LPP；D.致病突變PDGFRB。

圖2 WES測序結(jié)果

A.USP2-NARS2；B.KMT2A-USP2。

3 討 論

嬰兒白血病是指發(fā)生于12月齡內(nèi)的白血病，其特點是ALL和急性粒細(xì)胞白血病(AML)分布相對均等，嬰兒ALL通常為急性B淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)，而罕見急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)[12]。KMT2A重排在兒童B-ALL人群中發(fā)生率不足2%，但在大約75%的嬰兒B-ALL中出現(xiàn)[12]。KMT2A基因(OMIM：159555)，全名為賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2A，既往也稱為MLL基因[3]，位于11號染色體q23.3。該基因編碼一個轉(zhuǎn)錄共激活因子，在早期發(fā)育和造血過程中起到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要作用[12]。KMT2A基因重排涉及多種伴侶基因，其轉(zhuǎn)錄物編碼的特異性蛋白質(zhì)是ALL發(fā)生的確切病因。在AML和混合表型急性白血病(MPAL)中也可檢測到KMT2A重排，其陽性率分別約為60%、15%[1,3,12]。KMT2A-r基因有120多種相關(guān)轉(zhuǎn)錄子亞型。因此，臨床醫(yī)生很難用RT-PCR檢測如此龐大的轉(zhuǎn)錄本。KTMT2A常見的伴侶基因包括AF4、AF6、AF9、ENL等[1]。

本研究通過RNA-seq發(fā)現(xiàn)1例嬰兒B-ALL合并KMT2A-USP2，并在該患兒中發(fā)現(xiàn)了USP2-NARS2融合轉(zhuǎn)錄本，該轉(zhuǎn)錄本既往被發(fā)現(xiàn)于賁門腺癌而非白血病中[13]。USP2基因(OMIM：604725)位于編碼泛素羧基末端水解酶2，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白水解、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和應(yīng)激反應(yīng)[14]。NARS2基因(OMIM：612803)編碼氨酰tRNA合成酶并在氧化磷酸化中發(fā)揮作用[15]。目前尚無研究證明KMT2A-USP2在白血病的發(fā)生、發(fā)展中的作用，猜測USP2基因作為伴侶基因調(diào)控KMT2A基因的功能，但仍需要進(jìn)一步的研究來證實這項假設(shè)。

自從報道了第一例KMT2A-USP2以來，目前通過二代測序技術(shù)共發(fā)現(xiàn)24例白血病合并KMT2A-USP2融合基因陽性，其中AML 2例、MPAL 8例、B-ALL 14例[4,7]。迄今為止，MEYER等[7]的研究中KMT2A-USP2重排的嬰兒和兒童白血病的例數(shù)最多，其包括了17例患者(8例男性和9例女性)，初診中位年齡為17個月。免疫分型主要為B-ALL(12例)，其次為MPAL(4例)，病初多表現(xiàn)為白細(xì)胞增多，易合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累(4例)，治療反應(yīng)差，預(yù)后差，與本研究中患兒相符。MEYER等[7,16]的研究中發(fā)現(xiàn)>95%的KMT2A重排中，KMT2A斷裂點位于其第8～14號外顯子，且明顯趨向于第9～12號外顯子，其中包括了最常見的KMT2A重排類型，并將其命名為主要斷裂點區(qū)域，而除此之外，還發(fā)現(xiàn)了另一個次要斷裂點區(qū)域，位于第19號內(nèi)含子到24號外顯子，且明顯趨向于第21～23號內(nèi)含子之間，大量新發(fā)現(xiàn)的KMT2A重排斷裂點發(fā)生于此，其中KMT2A-USP2均發(fā)現(xiàn)于次要斷裂點區(qū)域，本研究中患兒KMT2A的斷裂點位于22號外顯子。

盡管KMT2A-USP2融合基因十分罕見，但近年研究表明其可能仍有大量未被發(fā)現(xiàn)的KMT2A-USP2案例。MEYER等[7]通過設(shè)計2 688個覆蓋于整個KMT2A基因的捕獲探針并使用Illumina平臺測序，這種方式發(fā)現(xiàn)了之前各種常規(guī)篩查陰性的KMT2A-USP2融合，同時還發(fā)現(xiàn)了另外尚未被報道的KMT2A-USP8重排，這種具有靶向的NGS技術(shù)更能發(fā)現(xiàn)發(fā)生于次要斷裂區(qū)的KMT2A重排。

總之，KMT2A重排在嬰兒白血病中陽性率高，但常規(guī)檢測手段如FISH、RT-PCR技術(shù)只能發(fā)現(xiàn)常見的KMT2A重排，對于常規(guī)檢測為陰性的嬰兒白血病，需警惕合并罕見KMT2A重排，當(dāng)懷疑存在KMT2A重排時，應(yīng)當(dāng)完善轉(zhuǎn)錄組測序或其他二代測序手段以明確。靶向覆蓋KMT2A基因的二代測序技術(shù)在嬰兒白血病中使用可更好地區(qū)分其危險度。KMT2A-USP2重排陽性患兒的治療反應(yīng)差，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)化療強(qiáng)度以達(dá)到MRD，有條件者可予以造血干細(xì)胞移植。