楊業(yè)靜 杜勇軍 劉 雷 李興艷

(廣西南寧市第二人民醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科，南寧市 530031，電子郵箱：30764656@qq.com)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)為自身免疫性疾病，多累及小關(guān)節(jié)，以關(guān)節(jié)炎癥、腫脹、疼痛為臨床表現(xiàn)，女性多于男性，多高發(fā)于50～65歲人群。RA的全球患病率為0.5%～1.0%，我國的患病率約為0.42%[1]。近幾年，RA患者因并發(fā)感染而住院的比例逐漸增加。一項(xiàng)對(duì)1993～2013年美國RA患者的大樣本多中心流行病學(xué)調(diào)查顯示，因感染住院的RA患者，從90/10萬人增至206/10萬人[2]。RA是威脅人民群眾身體健康的重大疾病，也是心血管疾病的危險(xiǎn)因素。但是RA的病因病機(jī)仍不十分明確，其發(fā)生與關(guān)節(jié)狀態(tài)、飲食、代謝、家族遺傳史等因素均有關(guān)。此外，越來越多的證據(jù)表明免疫紊亂參與了RA的發(fā)病，有學(xué)者在RA患者的滑膜組織中觀察到白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1、IL-4等炎癥免疫因子的浸潤,以及自身抗體的沉積[3-4]。但是由于免疫系統(tǒng)疾病的復(fù)雜性，任何單一的假設(shè)均不能較好地解釋免疫紊亂在RA發(fā)病中的作用機(jī)制。

生物信息學(xué)是一門新興的學(xué)科，它將計(jì)算機(jī)與自然科學(xué)相聯(lián)系，能用于解釋復(fù)雜的生物機(jī)體，基因組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等均屬于生物信息學(xué)范疇，該學(xué)科的發(fā)展為了解生理病理變化提供了新的思路。GEO數(shù)據(jù)庫是用于儲(chǔ)存芯片及測序數(shù)據(jù)的一個(gè)數(shù)據(jù)庫，利用現(xiàn)有的公共生物數(shù)據(jù)庫能整合多組不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果，更好地挖掘潛在的信息。因此，本研究利用公共數(shù)據(jù)庫，并聯(lián)合多個(gè)RA滑膜組織的芯片，分析RA的差異表達(dá)基因以及免疫相關(guān)基因，進(jìn)一步篩選T、B細(xì)胞的關(guān)鍵基因，并利用單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)驗(yàn)證關(guān)鍵基因的表達(dá)，以探討免疫紊亂在RA發(fā)病中的作用機(jī)制，并篩選小分子藥物以干預(yù)RA。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 從GEO數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載人類RA滑膜組織基因芯片數(shù)據(jù)，共有3個(gè)RA基因芯片數(shù)據(jù)納入研究，其基本信息見表1，納入標(biāo)準(zhǔn)：樣品組織來源于滑膜，并同時(shí)包含RA的滑膜組織及正常對(duì)照組的滑膜組織。同時(shí)，下載RA小鼠外周血單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)(GSE141105)。

表1 RA基因芯片信息

1.2 差異基因分析 首先對(duì)3個(gè)RA數(shù)據(jù)集的基因表達(dá)量進(jìn)行l(wèi)og2校正以及基因名稱注釋。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行批次校正聯(lián)合分析后，利用R語言中的limma數(shù)據(jù)包分析基因芯片中差異表達(dá)的基因，以adj.P≤0.05、|log2FC|≥1為篩選差異表達(dá)基因的條件。利用R 語言中的火山圖和熱圖可視化數(shù)據(jù)。

1.3 富集分析 利用R語言的clusterProfiler包對(duì)得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析以及基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析。以P<0.05表示富集的通路有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)通過鄰接矩陣、拓?fù)渲丿B矩陣等方法，對(duì)相關(guān)性值進(jìn)行冪次運(yùn)算，從而將基因劃分不同的模塊。利用R語言的WGCNA包進(jìn)行WGCNA分析，以分析RA的差異表達(dá)基因中存在相似表達(dá)模式的基因，并篩選關(guān)鍵模塊。

1.5 免疫相關(guān)基因及免疫細(xì)胞浸潤分析 (1)通過GO富集分析的“immune system process”篩選RA差異表達(dá)基因中與免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因；利用STRING10(http：//www.string-db.org)構(gòu)建免疫相關(guān)差異表達(dá)基因編碼蛋白的蛋白-蛋白相互作用 (protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),并使用Cytoscape軟件的插件Cytohubb篩選免疫相關(guān)的關(guān)鍵基因。(3)通過濃縮分?jǐn)?shù)、補(bǔ)償矩陣校正等算法，計(jì)算經(jīng)校正后的3個(gè)RA數(shù)據(jù)集的基因表達(dá)量，得到免疫細(xì)胞含量矩陣，進(jìn)一步得出免疫細(xì)胞浸潤比例[5]，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用Pearson相關(guān)性分析評(píng)價(jià)關(guān)鍵基因表達(dá)量與免疫細(xì)胞含量矩陣的相關(guān)性，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 關(guān)鍵免疫相關(guān)基因在免疫細(xì)胞中表達(dá)情況的驗(yàn)證 利用RA小鼠外周血單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)集GSE141105進(jìn)一步驗(yàn)證1.5中所得到的關(guān)鍵基因在T、B淋巴細(xì)胞中的表達(dá)情況。采用秩和檢驗(yàn)比較單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)集GSE141105中正常組和RA組淋巴細(xì)胞之間關(guān)鍵免疫相關(guān)基因的表達(dá)差異，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RA相關(guān)差異表達(dá)基因的篩選結(jié)果 對(duì)3個(gè)不同數(shù)據(jù)集進(jìn)行批次校正后，共獲得差異表達(dá)基因632個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的基因369個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因263個(gè)，在熱圖中(見圖1)顯示了10個(gè)最顯著的差異表達(dá)基因，包括蛋白酶體20S亞單位β 9(proteasome 20S subunit beta 9,PSMB9)、泡狀過表達(dá)癌癥促生存蛋白1(vesicular,overexpressed in cancer,prosurvival protein 1,VOPP1)、γ氨基丁酸A型受體相關(guān)蛋白1(γ-aminobutyric acid type A receptor associated protein like 1,GABARAPL1)、蛋白質(zhì)sel-1同源物3(protein sel-1 homolog 3，SEL1L3)、磷脂酶C-γ-2(phospholipase C γ 2,PLCG2)、C-X-C基序趨化因子配體(C-X-C motif chemokine ligand，CXCL)13、免疫球蛋白重鏈常數(shù)μ(immunoglobulin heavy constant μ,IGHM)、免疫球蛋白κ常數(shù)(immunoglobulin κ constant，IGKC)、去整合素和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白脫溶素1(a disintegrin and metalloproteinase domain-like decysin 1,ADAMDEC1)、黑色素調(diào)節(jié)蛋白(melanoregulin,MREG)。其他差異表達(dá)基因包括Toll樣受體7(Toll-like receptor 7，TLR7)、腫瘤壞死因子配體超家族成員11(tumor necrosis factor super family 11，TNFSF11)、C-C基序趨化因子受體(C-C motif chemokine receptor，CCR)5、C-X-C基序趨化因子受體3(C-X-C motif chemokine receptor 3，CXCR3)、CXCL1(|log2FC|分別為1.55、1.42、1.77、1.00、2.418，adj.P值分別為3.877×10-9、2.554×10-8、2.87×10-9、18×10-5、9.20×10-9)。

圖1 RA差異表達(dá)基因的火山圖(A)與熱圖(B)

2.2 富集分析結(jié)果 對(duì)632個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，GO分析結(jié)果顯示，顯著性位列前5的生物過程包括轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子活性(GO:0003712)、細(xì)胞黏附分子結(jié)合(GO:0050839)、近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合(GO:0000987)、RNA聚合酶Ⅱ近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合(GO:0000978)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性/RNA聚合酶Ⅱ特異性(GO:0001228)；而KEGG富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集在磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號(hào)通路(hsa04151)、EB病毒感染(hsa04010)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路(hsa05169)、人乳頭瘤病毒感染(hsa05165)、人T細(xì)胞白血病病毒1感染(hsa05166)等信號(hào)通路。

2.3 WGCNA分析結(jié)果 通過WGCNA分析共獲得4個(gè)模塊(見圖2A)，其中綠松石模塊共獲得357個(gè)基因，藍(lán)色模塊共獲得107個(gè)基因，棕色模塊共獲得91個(gè)基因，黃色模塊共獲得77個(gè)基因。由于綠松石模塊包含的基因數(shù)最多，同時(shí)綠松石模塊與藍(lán)色和棕色模塊有較高的相關(guān)性(見圖2B)，因此推測綠松石模塊的基因可能在RA的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。KEGG富集分析結(jié)果顯示，綠松石模塊基因顯著富集在趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、原發(fā)性免疫缺陷、T細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑、核因子κB信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑、破骨細(xì)胞分化、自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性等通路，見圖2C；藍(lán)色模塊基因主要富集在光轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、TNF信號(hào)通路、用于IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)等信號(hào)通路；棕色模塊基因主要富集在肺結(jié)核、FcγR介導(dǎo)的吞噬作用、RA、金黃色葡萄球菌感染等信號(hào)通路；黃色模塊基因主要富集在過氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)信號(hào)通路、AMP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞中脂解的調(diào)控、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、酪氨酸代謝、脂肪酸降解等信號(hào)通路。

圖2 WGCNA分析結(jié)果

2.4 免疫細(xì)胞浸潤分析結(jié)果 通過比較正常滑膜組織和RA組織之間的免疫細(xì)胞浸潤比例，發(fā)現(xiàn)RA滑膜組織中細(xì)胞毒性T細(xì)胞、1型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(type 1 regulatory T cell,Treg1)、B淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、中央記憶型T細(xì)胞浸潤比例增多，而誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (inducible regulatory T cell,iTreg)、Th17細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞(follicular helper T cell,Tfh)、NK細(xì)胞、NK T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤的比例減少，見圖3。

圖3 免疫細(xì)胞浸潤分析的小提琴圖

2.5 免疫相關(guān)基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性研究 在RA差異表達(dá)基因中，共篩選到免疫相關(guān)基因234個(gè)，這234個(gè)基因共涉及52條通路。其中有2條與B淋巴細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)通路，為B細(xì)胞受體信號(hào)通路和調(diào)節(jié)B細(xì)胞調(diào)節(jié)相關(guān)免疫，共涉及84個(gè)免疫相關(guān)基因；將這84個(gè)免疫相關(guān)基因進(jìn)行PPI分析后，利用Cytohubb插件篩選關(guān)鍵基因(圖4A)，其中前5個(gè)最關(guān)鍵的基因?yàn)镃R2、PAX5、CCL19、UBASH3A、TRAT1。進(jìn)一步將這5個(gè)基因的表達(dá)量與免疫細(xì)胞浸潤分析得到的B 淋巴細(xì)胞矩陣進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示CR2、PAX5、CCL19、UBASH3A、TRAT1的表達(dá)量與B淋巴細(xì)胞矩陣呈正相關(guān)(r=0.533、0.750、0.669、0.769、0.741,P=0.001、<0.001、<0.001、<0.001、<0.001)，見圖5。

圖4 免疫相關(guān)基因的PPI圖

此外，共得到13條與T淋巴細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)通路，包括T細(xì)胞的激活、T細(xì)胞的趨化等信號(hào)通路，涉及202個(gè)免疫相關(guān)基因，按照前述方法獲得關(guān)鍵基因(圖4B)，其中前5個(gè)最關(guān)鍵的基因?yàn)镃CR7、CXCR3、ITGAX、GZMB、PRF1。進(jìn)一步將這5個(gè)基因的表達(dá)量與免疫細(xì)胞浸潤分析得到的T淋巴細(xì)胞矩陣進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示CXCR3、CCR7、PRF1、GZMB基因的表達(dá)量與CD8+T淋巴細(xì)胞矩陣呈正相關(guān)(r=0.571、0.853、0.746、0.596，均P<0.001)，CXCR3、CCR7、PRF1基因的表達(dá)量與Treg1細(xì)胞矩陣呈正相關(guān)(r=0.432、0.374、0.263，P=0.010、0.027、0.045)，CXCR3、CCR7、PRF1、GZMB基因的表達(dá)量與中央記憶型T細(xì)胞矩陣呈正相關(guān)(r=0.458、0.612、0.676、0.364，P=0.006、<0.001、<0.001、<0.001)，CCR7、GZMB、PRF1基因的表達(dá)量與細(xì)胞毒性T細(xì)胞矩陣呈正相關(guān)(r=0.462、0.688、0.651，P=0.005、<0.001、<0.001)，CCR7、GZMB基因的表達(dá)量與iTreg細(xì)胞矩陣呈負(fù)相關(guān)(r=-0.726、-0.491，P<0.001、0.003)，見圖5。

圖5 關(guān)鍵免疫相關(guān)基因與T、B淋巴細(xì)胞的相關(guān)性分析

2.6 關(guān)鍵免疫相關(guān)基因在RA免疫細(xì)胞中表達(dá)的驗(yàn)證 單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)集GSE141105共包含4 310個(gè)細(xì)胞，經(jīng)注釋后，共獲得正常組B淋巴細(xì)胞136個(gè)和RA組B淋巴細(xì)胞1 165個(gè)，以及正常組CD4+T淋巴細(xì)胞81個(gè)和RA組CD4+T淋巴細(xì)胞369個(gè)。結(jié)果顯示，RA組和正常組CD4+T淋巴細(xì)胞中僅ITGAX基因的表達(dá)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，RA組和正常組B淋巴細(xì)胞中CR2、PAX5、UBASH3A基因的表達(dá)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表2和表3。

表2 正常組與RA組CD4+T細(xì)胞中關(guān)鍵基因表達(dá)量的比較

表3 正常組與RA組B淋巴細(xì)胞中關(guān)鍵基因表達(dá)量的比較

3 討 論

本研究通過多芯片基因數(shù)據(jù)，共得到632個(gè)差異表達(dá)基因，其中最顯著的10個(gè)差異表達(dá)基因分別為：PSMB9、VOPP1、GABARAPL1、SEL1L3、PLCG2、CXCL13、IGHM、IGKC、ADAMDEC1、MREG。其中，VOPP1通過促進(jìn)核因子κB1的核易位來增加其轉(zhuǎn)錄活性[6]，而核因子κB1與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)；CXCL13是B淋巴細(xì)胞趨化因子；IGHM是B細(xì)胞的抗原識(shí)別分子；IGKC是一種蛋白質(zhì)編碼基因，與IGKC有關(guān)的疾病包括免疫球蛋白κ輕鏈缺乏癥和漿細(xì)胞瘤；ADAMDEC1編碼的基因?qū)儆谡纤亟饘俚鞍酌讣易宓姆置诘鞍祝瑯渫粻罴?xì)胞成熟過程中其表達(dá)上調(diào)，該蛋白可能在樹突狀細(xì)胞功能及其與生發(fā)中心T細(xì)胞的相互作用中起重要作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)多個(gè)差異表達(dá)基因也與免疫相關(guān)，如TLR7、TNFSF11。其中，TLR7受體是天然免疫的一種模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別病原相關(guān)模式分子從而引發(fā)先天性免疫反應(yīng)并啟動(dòng)獲得性免疫反應(yīng)。目前已知TLR7激動(dòng)劑能夠使初始B細(xì)胞增殖及活化，有研究表明滑膜組織釋放的微小RNA-21能介導(dǎo)TLR7激活，導(dǎo)致膝骨關(guān)節(jié)炎疼痛，而TLR7拮抗劑還對(duì)膝蓋骨性關(guān)節(jié)炎疼痛具有持久的鎮(zhèn)痛作用[7]。TNFSF11是RANK的配體，在骨的分化中起重要作用，能通過激活破骨細(xì)胞前體細(xì)胞中的多個(gè)信號(hào)通路來誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成。同時(shí)，TNFSF11還參與免疫反應(yīng)，能增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞刺激幼稚T細(xì)胞增殖的能力，其可能是T細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞之間相互作用的重要調(diào)節(jié)劑，并且可能在T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[8]。

我們進(jìn)一步通過WGCNA分析將RA的差異表達(dá)基因劃分為不同的模塊。最為重要的綠松石模塊富集在免疫反應(yīng)和破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路，說明免疫與骨分化紊亂可能是RA最重要的發(fā)病機(jī)制。而在免疫細(xì)胞浸潤分析中我們也發(fā)現(xiàn)，滑膜組織中伴多種免疫細(xì)胞浸潤，其中B淋巴細(xì)胞胞浸潤比例增多。B淋巴細(xì)胞在RA發(fā)病中的作用已經(jīng)被廣泛證明。RA患者的滑膜組織中存在異位生發(fā)中心，B淋巴細(xì)胞可在滑膜組織中被激活；活化的B淋巴細(xì)胞參與抗原驅(qū)動(dòng)的特異性免疫反應(yīng)，可以分化成為高親和力抗體的漿細(xì)胞；大多數(shù)RA患者血清中均可檢測到自身抗體，人軟骨糖蛋白39、Ⅱ型膠原蛋白、聚合素等均可能是體內(nèi)的自身抗原，且60%～80%的RA患者中的自身抗體具有高親和力[9]；抗原與抗體形成免疫復(fù)合物，可以進(jìn)一步激活補(bǔ)體，從而損傷關(guān)節(jié)滑膜組織等。此外，滑膜組織中的B淋巴細(xì)胞激活因子、TNF家族、CXCL13、CXCL1是影響滑膜組織中B細(xì)胞激活、分化和趨化的重要細(xì)胞因子[10]。本研究中，RA滑膜組織中差異表達(dá)基因TNFSF11、CCR5、CXCR3、CXCL1表達(dá)上調(diào)，提示這些B細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子也促進(jìn)了RA的發(fā)病。

本研究結(jié)果還顯示，RA組和正常組B淋巴細(xì)胞中CR2、PAX5、UBASH3A基因的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。CR2主要表達(dá)于人成熟B淋巴細(xì)胞的表面，在CR2-/-的小鼠腹膜中B淋巴細(xì)胞顯著減少，且此類小鼠對(duì)T依賴性抗原的體液反應(yīng)存在嚴(yán)重缺陷，其血清抗體滴度降低以及脾濾泡中生發(fā)中心的數(shù)量和大小減少，而該缺陷是由于B淋巴細(xì)胞本身引起的[11]。PAX5是早期B淋巴細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，該基因的靶向突變可在前體B淋巴細(xì)胞階段阻止B細(xì)胞淋巴發(fā)育，且其還能通過抑制非B系基因以維持B淋巴細(xì)胞自穩(wěn)[12]。PAX5轉(zhuǎn)錄可促進(jìn)E2A缺陷型小鼠的前體 B淋巴細(xì)胞發(fā)育[13]。UBASH3A是編碼T細(xì)胞泛素配體(TULA)家族的成員之一。有研究顯示UBASH3A基因的多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡等其他免疫性疾病相關(guān)[14]，這提示UBASH3A基因?qū)Υ龠M(jìn)免疫性疾病的發(fā)生具有重要作用，但是具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。此外，UBASH3A被認(rèn)為是RA的易感基因。有學(xué)者對(duì)916例RA患者和2 266例健康者進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，UBASH3A的遺傳變異使?jié)h族人更易發(fā)生RA，且UBASH3A基因rs1893592位點(diǎn)與RA的C反應(yīng)蛋白水平和骨侵蝕疾病狀態(tài)顯著相關(guān)[15]。

此外，T淋巴細(xì)胞也廣泛參與了RA的發(fā)病，T細(xì)胞在RA滑膜組織中處于慢性活化狀態(tài)[16]。鄭小娟等[17]分析了137例RA患者血清中Th的亞型，發(fā)現(xiàn)RA患者的Th總數(shù)增加，其中Th1/Th2、Th17/Treg高于健康人群。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞趨化因子受體CCR5及CXCR3在RA組織中表達(dá)上調(diào)，這提示T淋巴細(xì)胞浸潤滑膜組織，可能是受到了趨化因子的影響。盡管有實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明CD4+T淋巴細(xì)胞參與了RA的發(fā)病，RA患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞比例升高[18]，但是本研究結(jié)果顯示，RA組滑膜組織中CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤比例減少，而CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤比例增高。Cho等[19]也發(fā)現(xiàn)，在RA患者的滑膜組織中，產(chǎn)生IL-10的抑制性CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著增加。而另外一項(xiàng)研究結(jié)果亦顯示，RA患者滑膜組織中效應(yīng)記憶性CD8+T淋巴細(xì)胞比例顯著高于外周血標(biāo)本，且表達(dá)CD25和CD69的CD8+T淋巴細(xì)胞比例明顯高于外周血標(biāo)本[20]。以上均提示CD8+T淋巴細(xì)胞在RA發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，免疫紊亂可能是RA的重要發(fā)病機(jī)制之一，RA患者滑膜組織中細(xì)胞毒性T細(xì)胞、Treg1細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤數(shù)量增多，其中CR2、PAX5、UBASH3A基因表達(dá)與B淋巴細(xì)胞顯著相關(guān)，這些免疫細(xì)胞和免疫相關(guān)基因可能在RA的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。但是本研究驗(yàn)證差異基因在免疫細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)，由于GSE141105數(shù)據(jù)集滑膜組織中所獲得的細(xì)胞量較少，且單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)包含較多差異表達(dá)量為0的數(shù)據(jù)，故本研究選擇在RA小鼠外周血單細(xì)胞集中進(jìn)行驗(yàn)證，但由于RA主要病變位于滑膜，故今后仍需要在滑膜組織中進(jìn)一步驗(yàn)證；此外，本研究僅采用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行分析，今后仍需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證所得結(jié)論。