謝芳 馬驂 吳玲玲 單宏杰 馬強(qiáng) 黃贊

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬宿州醫(yī)院，宿州市立醫(yī)院1腫瘤外科，2病理科（安徽宿州234000）

乳腺癌的發(fā)病率正在逐年升高，且發(fā)病人群逐漸年輕化，成為威脅女性生命健康的罪魁禍?zhǔn)祝?-3］。它的發(fā)生、發(fā)展與環(huán)境、遺傳以及腫瘤所處的微環(huán)境等一些復(fù)雜分子生物學(xué)因素密切相關(guān)，免疫系統(tǒng)在此過程中也起著重要調(diào)控作用［4-5］。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）是以淋巴細(xì)胞為主的存在于腫瘤癌巢內(nèi)及間質(zhì)中的異質(zhì)性淋巴細(xì)胞群體。TILs 的出現(xiàn)，是宿主免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原免疫應(yīng)答的標(biāo)志，反映了腫瘤局部發(fā)生的免疫反應(yīng)，腫瘤原發(fā)灶中TILs的水平反映了機(jī)體的抗腫瘤能力，其數(shù)量也預(yù)示著腫瘤的治療效果［6］。乳腺癌的新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）可以使腫瘤降期降級，提高保乳率及手術(shù)R0 切除率，是乳腺癌綜合治療的重要組成部分。選取敏感適宜可量化的分子標(biāo)志物，準(zhǔn)確評估個(gè)體NAC 的療效，以避免無效治療延誤患者病情，是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。本研究通過計(jì)算不同亞型乳腺癌患者NAC 前粗針穿刺標(biāo)本中的TILs 比例、術(shù)后病理學(xué)評估大體標(biāo)本的化療反應(yīng)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，來探討TILs 比例能否作為NAC 療效預(yù)測的一個(gè)可靠的生物學(xué)指標(biāo)，從而輔助決策乳腺癌病患NAC 方案，以期實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)個(gè)體化治療。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2019年7月至2020年7月期間我院腫瘤外科56 例乳腺癌患者的臨床病理資料，入院均予粗針穿刺活檢確診后行NAC 后完成手術(shù)?；颊呔鶠榕?，年齡31 ～69 歲，中位年齡47 歲，腫瘤最大徑1.8 ～6.0 cm，中位直徑3.4 cm，臨床分期Ⅱ期24 例，Ⅲ期32 例，分子亞型Luminal型17 例，HER-2 陽性20 例（包括HR 陽性及HR陰性），三陰性16 例，3 例患者因免疫組化HER-2（2+）未行cerbB2 基因檢測，故未分型。所有患者均簽署知情同意書，予含蒽環(huán)類和/或紫杉類藥物方案的NAC，15 例HER-2 陽性患者NAC 聯(lián)合靶向治療，中位化療次數(shù)4 次。

1.2 TILs 比例計(jì)算TILs 可分為腫瘤內(nèi)浸潤性淋巴細(xì)胞（iTILs）和腫瘤間質(zhì)浸潤性淋巴細(xì)胞（sTILs），以及少量侵犯腫瘤邊界的浸潤性淋巴細(xì)胞（imTILs）［7］。國際TILs 評價(jià)工作組目前推薦以sTILs 應(yīng)用于臨床研究工作［8］。利用HE 染色方法對新輔助化療前穿刺的癌組織標(biāo)本進(jìn)行染色，200 高倍鏡視野下計(jì)算出腫瘤癌巢內(nèi)及間質(zhì)中含TILs 的面積與腫瘤總面積的百分比，取其均值定義為TILs 比例。并根據(jù)比例大小分為低、中、高三組，TILs 比例≤5%為低比例組，TILs 比例在6%～49%為中比例組，TILs 比例≥50%為高比例組。

1.3 新輔助化療療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)日本乳腺癌協(xié)會分類評估系統(tǒng)（2007年）評估術(shù)后大體標(biāo)本的新輔助化療療效。根據(jù)組織學(xué)改變將化療反應(yīng)分為0 級、Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級共4 個(gè)等級。0 級：無效應(yīng)，癌細(xì)胞在治療后幾乎無變化；Ⅰ級：輕微反應(yīng)，癌組織有變化但占總面積的2/3 以下；Ⅱ級：明顯反應(yīng)，癌組織有明顯變化達(dá)到或超過總面積的2/3，但仍有明確癌細(xì)胞殘留；Ⅲ級：完全反應(yīng)，所有癌組織壞死或消失、被肉芽組織或纖維組織替代，或僅殘留少量導(dǎo)管內(nèi)癌成分。病理療效評估由兩位高年資病理醫(yī)師共同閱片完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher′s 確切概率法。多因素分析采用有序多分類logistic 回歸。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新輔助治療的療效56 例乳腺癌患者中有15例患者NAC同時(shí)聯(lián)合曲妥珠單抗靶向治療，NAC方案均含蒽環(huán)類和/或紫杉類藥物，所有患者在完成2 ～6 個(gè)療程治療后行手術(shù)治療。術(shù)后根據(jù)大體標(biāo)本中腫瘤組織的化療反應(yīng)進(jìn)行療效評價(jià)，結(jié)果顯示NAC 的總體有效率為76.8%（43/56），有13 例患者化療反應(yīng)為0 級，提示NAC 無效；24 例患者化療反應(yīng)為Ⅰ級，占比42.9%；12 例患者化療反應(yīng)為Ⅱ級，占比21.4%；7 例患者化療反應(yīng)為Ⅲ級，占比12.5%。

2.2 各臨床病理因素與乳腺癌新輔助化療療效的相關(guān)性本研究顯示，患者行新輔助治療前的臨床分期、腋窩淋巴結(jié)以及ER、PR、HER-2 狀態(tài)、Ki-67 指數(shù)與化療反應(yīng)無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。術(shù)后病理學(xué)評估顯示TILs 高比例組的癌組織化療反應(yīng)達(dá)到Ⅱ級或Ⅲ級的比例要高于TILs 低比例組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。提示較高的TILs 比例與乳腺癌NAC 的療效相關(guān)，可以預(yù)測乳腺癌新輔助化療療效，這與既往研究［9-12］一致。圖1 為HE 染色方法檢測的癌組織中具有代表性的化療反應(yīng)為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級和TILs 低、中、高比例的圖片。

圖1 HE 染色方法檢測的腫瘤組織中TILs 低、中、高比例及化療反應(yīng)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級鏡下表現(xiàn)（×200）Fig.1 Ⅰ，Ⅱ，and Ⅲgrades of responses to chemotherapy and Low-，intermediate-，and high-fraction of TILs were detected in breast tumors by using hematoxylin and eosin staining（×200）

表1 56 例乳腺癌患者的臨床病理因素與新輔助化療療效的關(guān)系Tab.1 Relationship between clinicopathological factors and response to chemotherapy in 56 patients with breast cancer

2.3 乳腺癌的分子亞型與TILs 比例的關(guān)系本研究入組了56 例患者，3 例患者免疫組化HER-2（2+）未行cerbB2 基因FISH 檢測，未行分子分型也未行靶向治療。53 例患者中分子亞型為Luminal型17 例，HER-2 陽性20 例，三陰性16 例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，13 例新輔助化療無效的患者以Luminal 型和HER-2 陽性為主，TNBC 患者腫瘤組織中的TILs 比例明顯高于Luminal 型及HER-2 陽性乳腺癌（P＜0.05），見表2。故推測無論何種類型乳腺癌，TILs比例與NAC 療效相關(guān)，在TNBC 中更為明顯，TILs有可能成為TNBC 免疫治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，這也與研究［13］一致。

表2 53例乳腺癌分子亞型與穿刺標(biāo)本中TILs比例的關(guān)系Tab.2 Relationship between TILs levels and molecular subtypes in 53 patients with breast cancer

2.4 新輔助化療療效的多因素分析Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，年齡、ER、PR 及HER-2 狀態(tài)、Ki-67 指數(shù)與化療反應(yīng)無明顯相關(guān)性。相較于低比例組，TILs 高比例為化療反應(yīng)一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測因子（OR= 0.04，95%CI：0.007 ～0.230；P＜0.05），見表3。

表3 各臨床病理因素與新輔助化療療效的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis of predictive factors for the response to chemotherapy

3 討論

NAC 在乳腺癌綜合治療中占重要地位，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床，其不僅能使局部晚期患者達(dá)到可手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)、使初診不能保乳患者獲得保乳的機(jī)會，還能預(yù)知腫瘤對化療藥物的敏感性，指導(dǎo)臨床化療藥物的選擇。盡管現(xiàn)有證據(jù)顯示NAC 總體上并不改善患者的預(yù)后［14］，但患者治療后如能達(dá)到病理學(xué)完全緩解（pCR），提示預(yù)后可能改善［15］。目前臨床尚缺乏合適的分子標(biāo)志物來準(zhǔn)確評估個(gè)體NAC 的療效。TILs 作為可以量化測量的敏感生物標(biāo)志物，可行性和再現(xiàn)性高，可較好地應(yīng)用于NAC 中。

1992年，AALTOMAA 等［16］發(fā)現(xiàn)乳腺癌原發(fā)病灶內(nèi)淋巴細(xì)胞的浸潤預(yù)示著較好的預(yù)后。隨著腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展，BIG2-98、ECOG2197 試驗(yàn)等多項(xiàng)研究［17-19］均論證了TILs 在早期乳腺癌中的預(yù)后價(jià)值。2016年圣安東尼奧乳腺癌大會上的一項(xiàng)針對3 771 例乳腺癌NAC 患者的Meta 分析顯示，對于乳腺癌所有的分子亞型，TILs 都是pCR 強(qiáng)有力的預(yù)測標(biāo)志，TILs 比例越高，pCR 率越高，在TNBC中這種高pCR 率可以延長患者DFS，轉(zhuǎn)為生存獲益。隨著對TILs 研究［10-12，20］的深入，專家們認(rèn)為，在Her-2 陽性和TNBC 乳腺癌NAC 中TILs 能提高pCR 率，且與預(yù)后（EFS、DFS、OS）密切相關(guān)。而在ER 陽性和HER-2 陰性乳腺癌中，TILs 的預(yù)后和預(yù)測作用仍有爭議［21-22］。目前國內(nèi)相關(guān)研究仍不多，且多為回顧性，也少有研究對所有患者的分子分型進(jìn)一步亞組分析。本研究為前瞻性研究，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)較高的TILs 比例可以預(yù)測乳腺癌新輔助化療的療效，基于分子分型的亞組分析顯示TNBC患者腫瘤組織中的TILs 比例明顯高于Luminal 型及HER-2 陽性乳腺癌患者。TNBC 相較于其他亞型缺乏明確的分子靶標(biāo)，且其惡性程度高、侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高，治療效果常常不理想，臨床實(shí)踐中治療選擇甚少［23］。據(jù)本研究推測，TILs 有望成為TNBC 免疫治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。多因素分析結(jié)果顯示，患者的化療反應(yīng)與較高的TILs 比例明確相關(guān)，而與年齡、ER、PR 及HER-2 狀態(tài)、Ki-67 指數(shù)無相關(guān)，提示TILs 比例是乳腺癌NAC 療效的獨(dú)立預(yù)測因子。由于研究條件及隨訪時(shí)間有限，納入的病例數(shù)較少，且不同患者NAC 藥物及療程有所差異，也會導(dǎo)致結(jié)果存在一定的偏倚。另外，相關(guān)研究［24-25］表明，TILs 分布的異質(zhì)性、TILs 在腫瘤中的空間結(jié)構(gòu)、以及不同的TILs 亞群都會影響TILs在抗腫瘤免疫中的作用。本研究未能篩選出TILs亞群進(jìn)一步分析，也會影響研究結(jié)果。

今后將會擴(kuò)大樣本量，延長隨訪時(shí)間，完善TILs 的評估機(jī)制，引用最新數(shù)字病理學(xué)技術(shù)來代替人工量化，使TILs的評估方法更準(zhǔn)確、更客觀；進(jìn)一步細(xì)化研究工作，希望通過對針對不同TILs 亞群分層研究進(jìn)一步深入了解，將其納入風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型，以期在不久的將來應(yīng)用于常規(guī)臨床實(shí)踐，指導(dǎo)輔助化療決策，更準(zhǔn)確地預(yù)測在新輔助環(huán)境中實(shí)現(xiàn)pCR 的機(jī)會，指導(dǎo)臨床為患者實(shí)施精準(zhǔn)個(gè)體化治療，改善患者遠(yuǎn)期預(yù)后。