夏旭 崔洪泉 胡培森 王交托

河南省中醫(yī)院（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院）泌尿外科（鄭州450000）

前列腺癌為男性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，對(duì)男性健康的危害性在全部腫瘤中位列第二［1］。目前，關(guān)于前列腺癌的傳統(tǒng)療法往往對(duì)局限性和激素敏感性病變有較好療效，但仍有小部分患者復(fù)發(fā)并轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化為激素抵抗型前列腺癌，這是泌尿腫瘤學(xué)最復(fù)雜的問(wèn)題［2］。地黃是傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥，可經(jīng)炮制、加工為熟地黃，熟地黃中多糖成分含量高，有抑瘤、增強(qiáng)免疫作用，已被證實(shí)在鼻咽癌等治療中獲取較為理想的效果［3-4］，但對(duì)前列腺癌細(xì)胞尤其是對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞作用的科學(xué)評(píng)價(jià)報(bào)道鮮見(jiàn)。據(jù)報(bào)道［5］，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路在多種惡性腫瘤發(fā)展中有重要作用，參與細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡。本實(shí)驗(yàn)猜測(cè)VEGF/Akt 信號(hào)通路在雄激素非依賴性前列腺癌發(fā)展中發(fā)揮了作用，故基于該通路分析熟地黃多糖對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡的影響，為熟地黃多糖在雄激素非依賴性前列腺癌治療中的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞人前列腺癌PC-3 細(xì)胞（上海傳秋生物科技有限公司，批號(hào)：CQ80165）。

1.1.2 藥物、試劑和儀器熟地黃多糖（陜西慈源生物有限公司，測(cè)定純度在90%以上），細(xì)胞凋亡AnnexinV/PI 檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD 公司），鼠抗人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）、Akt、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）、p-Akt單克隆抗體（一抗）（美國(guó)Abcam 公司），辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的純化山羊抗小鼠IgG 二抗、β-actin 抗體（北京百奧萊博科技有限公司）。Transwell 小室（美國(guó)BD 公司），CytoFLEX 流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組將凍存的人前列腺癌PC-3 細(xì)胞復(fù)蘇，再置入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，常規(guī)更換培養(yǎng)液，細(xì)胞貼壁后，采用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。將PC-3細(xì)胞接種在96 孔板內(nèi)，確保每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)約有1 ×106個(gè)細(xì)胞，每孔加入0.18 mL DMEM 培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24 h，PC-3 細(xì)胞貼壁后可分為4 組：空白組、低、中、高劑量組，分別予以0、20、40、60 μmol/L 熟地黃多糖溶液處理，每組平行設(shè)置5 個(gè)樣本。

1.2.2 MTT 法檢測(cè)人前列腺癌PC-3 細(xì)胞增殖情況取各組細(xì)胞，按上述方法培養(yǎng)24、48、72 h 后，滴入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，在培養(yǎng)孔內(nèi)加入150 μL DMSO，搖床輕微震蕩10 min。采用Bio-Tek808 酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm 波長(zhǎng)處每孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=（1-劑量組平均吸光度值/空白組平均吸光度值）×100%。

1.2.3 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PC-3 細(xì)胞侵襲能力采用OPTI-MEM培養(yǎng)基按3∶1比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠，鋪于Transwell 小室內(nèi)，每孔40 μL，置入37 ℃孵箱內(nèi)反應(yīng)1 h，待Matrigel 基質(zhì)膠凝固后備用。取各組細(xì)胞，按上述方法培養(yǎng)細(xì)胞72 h 后，采用胰蛋白酶消化、重懸，將細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié)為1 × 106個(gè)/mL，再將200 μL 細(xì)胞懸液接種在Transwell 小室上室（鋪有Matrigel 基質(zhì)膠），再取600 μL 完全培養(yǎng)基加入下室，置入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)持續(xù)培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室，拭凈Transwell 小室膜上PC-3細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，以0.2%結(jié)晶紫對(duì)膜下PC-3 細(xì)胞進(jìn)行染色，光鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5 個(gè)高倍視野下細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)紫色染色穿膜細(xì)胞，取平均值，即細(xì)胞侵襲能力。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC-3 細(xì)胞凋亡率采用Annexin-V-FITC/PI 雙染法檢測(cè)PC-3 細(xì)胞凋亡情況，取各組細(xì)胞，（1 × 106/孔）接種至6 孔板培養(yǎng)至72 h，再收集細(xì)胞，參考Annexin-V-FITC/PI 凋亡試劑盒步驟染色，即去離子水稀釋10×Binding Buffer為1×Binding Buffer，收集細(xì)胞，使用預(yù)冷1×PBS 重懸細(xì)胞1 次，2 000 rpm 離心10 min，洗滌細(xì)胞，加入300 μL 的1×Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，Annexin-VFITC 標(biāo)記，上機(jī)前5 min 加入5 μL 的PI 染色進(jìn)行PI 標(biāo)記，上機(jī)前補(bǔ)加200 μL 的1×Binding Buffer，上流式細(xì)胞儀檢驗(yàn)，以相應(yīng)軟件分析。

1.2.5 Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)VEGF/Akt 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)取各組細(xì)胞，接種至6 孔板培養(yǎng)至72 h，轉(zhuǎn)入離心管，2 500 ×g離心10 min，棄上清液，按細(xì)胞量加入細(xì)胞抽提試劑，裂解15 min。1 000 ×g離心10 min，棄上清液，BCA 法提取總蛋白。調(diào)節(jié)蛋白濃度，加入1/5 體積的5×Buffer，沸水浴10 min 變性，每孔上樣20 μg，采用10%濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，0.1% TBST 洗膜5 次。一抗孵育VEGFR2（1∶400）、Akt（1∶500）、PI3K（1∶500）、p-Akt（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）抗體，4 ℃過(guò)夜，TBST 緩沖液洗膜2 次，HRP 標(biāo)記的純化山羊抗小鼠IgG 二抗（1∶2 000）室溫孵育0.5 h。ECL 顯色，采集圖像分析，目的蛋白與β-actin 灰度值之比為VEFGR2、Akt、p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，再用t檢驗(yàn)行兩兩比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熟地黃多糖對(duì)人前列腺癌PC-3 細(xì)胞增殖的抑制作用隨著熟地黃多糖處理濃度增加，PC-3細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，呈明顯濃度依賴性，且呈時(shí)間梯度升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度熟地黃多糖對(duì)PC-3 細(xì)胞增殖抑制率Tab.1 Inhibitory rate of Rehmannia glutinosa polysaccharide on PC-3 cell proliferation at different time and concentrations ±s，%

表1 不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度熟地黃多糖對(duì)PC-3 細(xì)胞增殖抑制率Tab.1 Inhibitory rate of Rehmannia glutinosa polysaccharide on PC-3 cell proliferation at different time and concentrations ±s，%

注：a 與空白組比較，P＜0.05；b 與低劑量組比較，P＜0.05；c 與中劑量組比較，P＜0.05；d與24 h比較，P＜0.05；e與48 h比較，P＜0.05

組別空白組低劑量組中劑量組高劑量組F 值P 值24 h 0.04±0.01 14.82±2.15a 37.69±4.34ab 45.98±5.48abc 165.430＜0.001 48 h 0.06±0.02 20.34±2.67ad 44.31±4.14abd 53.18±5.17abcd 226.244＜0.001 72 h 0.11±0.03 29.64±3.88ade 49.66±5.19abde 67.48±6.43abcde 200.316＜0.001

2.2 熟地黃多糖對(duì)人前列腺癌PC-3 細(xì)胞侵襲能力的影響隨著熟地黃多糖處理濃度增加，PC-3細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)逐漸減少，有明顯濃度依賴性（P＜0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

表2 不同濃度熟地黃處理PC-3 細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)Tab.2 The number of penetrating cells in PC-3 cells treated with different concentrations of Rehmannia glutinosa ±s

表2 不同濃度熟地黃處理PC-3 細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)Tab.2 The number of penetrating cells in PC-3 cells treated with different concentrations of Rehmannia glutinosa ±s

注：a 與空白組比較，P＜0.05；b 與低劑量組比較，P＜0.05；c 與中劑量組比較，P＜0.05

組別 空白組 低劑量組 中劑量組 高劑量組F 值P 值穿膜細(xì)胞數(shù)（個(gè)/視野）44.78±3.5236.14±3.38a25.58±2.46ab12.78±1.08abc122.899＜0.001

圖1 不同濃度熟地黃處理PC-3 細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)（結(jié)晶紫染色，×40）Fig.1 The number of invasive cells in PC-3 cells treated with different concentrations of Rehmannia glutinosa（crystal violet staining，×40）

2.3 熟地黃多糖對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡率的影響隨著熟地黃多糖處理濃度增加，PC-3 細(xì)胞凋亡率逐漸升高，有明顯濃度依賴性（P＜0.05）。見(jiàn)表3、圖2。

表3 不同濃度熟地黃處理PC-3 細(xì)胞凋亡率Tab.3 apoptosis rate of PC-3 cells treated with different concentrations of Rehmannia glutinosa ±s

表3 不同濃度熟地黃處理PC-3 細(xì)胞凋亡率Tab.3 apoptosis rate of PC-3 cells treated with different concentrations of Rehmannia glutinosa ±s

注：a 與空白組比較，P＜0.05；b 與低劑量組比較，P＜0.05；c 與中劑量組比較，P＜0.05

空白組 低劑量組 中劑量組 高劑量組F 值P 值組別凋亡率1.03±0.19 8.77±0.69a 17.57±1.42ab 21.97±1.71abc 318.803＜0.001

圖2 不同濃度熟地黃處理PC-3 細(xì)胞凋亡率Fig.2 Apoptosis rate of PC-3 cells treated with different concentrations of Rehmannia glutinosa

2.4 人前列腺癌PC-3細(xì)胞中VEGF/Akt 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)隨著熟地黃多糖處理濃度增加，PC-3 細(xì)胞中VEGFR2、p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)，有明顯濃度依賴性（P＜0.05），PI3K、Akt 蛋白表達(dá)組間對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4、圖3。

表4 不同濃度熟地黃處理PC-3 細(xì)胞中VEGF/Akt 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)Tab.4 expression of VEGF/Akt signaling pathway related proteins in PC-3 cells treated with different concentrations of Rehmannia glutinosa ±s

表4 不同濃度熟地黃處理PC-3 細(xì)胞中VEGF/Akt 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)Tab.4 expression of VEGF/Akt signaling pathway related proteins in PC-3 cells treated with different concentrations of Rehmannia glutinosa ±s

注：與空白組比較，aP＜0.05；與低劑量組比較，bP＜0.05；與中劑量組比較，cP＜0.05

組別VEGFR2Aktp-AktPI3Kp-PI3K空白組0.88±0.131.25±0.140.91±0.111.20±0.130.88±0.12 aa 低劑量組中劑量組高劑量組F 值P 值0.65±0.11 0.49±0.09ab 0.32±0.05abc 28.704＜0.001 1.22±0.16 1.26±0.17 1.24±0.15 0.060 0.980 0.58±0.09 0.37±0.06ab 0.25±0.03abc 67.713＜0.001 1.21±0.15 1.19±0.17 1.22±0.14 0.038 0.990 0.52±0.11 0.31±0.08 0.20±0.03 53.033＜0.001

圖3 PC-3 細(xì)胞中VEGF/Akt 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)Western blot 條帶圖Fig.3 Expression of VEGF/Akt signaling pathway related proteins in PC-3 cells by Western blot

3 討論

前列腺癌發(fā)病機(jī)制與原癌基因激活，抑癌基因失活密切相關(guān)，細(xì)胞增殖、凋亡失衡為其發(fā)生和發(fā)展的主要因素［6］。中藥乃我國(guó)藥用資源寶庫(kù)，大約50%的癌癥化療藥物源自中藥材天然產(chǎn)物及其衍生物，部分中藥具有抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的效果［7-8］。地黃有“補(bǔ)血之君，壯水之主”的美稱，是傳統(tǒng)延年益壽的中藥，熟地黃多糖作為地黃有效成分之一，在改善腫瘤微環(huán)境、抑制腫瘤增殖轉(zhuǎn)移等有良好效果。因此選用熟地黃多糖為實(shí)驗(yàn)藥物，分析治療前列腺癌中的抗腫瘤活性以及誘導(dǎo)凋亡機(jī)制，為新藥研發(fā)奠定藥理基礎(chǔ)。

李哲等［9］在抑制鼻咽癌增殖轉(zhuǎn)移中靶向采用熟地黃多糖治療，發(fā)現(xiàn)熟地黃多糖在鼻咽癌增殖轉(zhuǎn)移抑制中有一定時(shí)間、劑量依賴性；董靜等［10］報(bào)道熟地黃多糖可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，共同提示了熟地黃多糖在抑制癌細(xì)胞增殖、凋亡方面有一定作用。本研究結(jié)果顯示：在0、20、40、60 μmol/L 熟地黃多糖處理前列腺癌PC-3 細(xì)胞72 h 后，PC-3 細(xì)胞增殖抑制率隨著熟地黃多糖濃度、培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而持續(xù)提高，提示地黃多糖對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞有增殖抑制作用，呈劑量、時(shí)間依賴效應(yīng)；在抑制前列腺癌PC-3 細(xì)胞侵襲、誘導(dǎo)凋亡方面，熟地黃多糖亦呈現(xiàn)出明顯劑量依賴性，初步證明了熟地黃多糖對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌有治療作用。

惡性腫瘤的產(chǎn)生、進(jìn)展實(shí)質(zhì)上是打破了細(xì)胞增殖、凋亡的動(dòng)態(tài)平衡，因而研究癌細(xì)胞增殖、侵襲以及凋亡機(jī)制十分必要［11-12］。信號(hào)通路是相關(guān)學(xué)者研究癌細(xì)胞凋亡的重點(diǎn)關(guān)注問(wèn)題，林星長(zhǎng)等［13］研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌PC-3 細(xì)胞抗凋亡的主要機(jī)制是抑制VEGF/Akt 信號(hào)通路。VEGF 受體家族包括VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3 三個(gè)成員，其中VEGFR2 是負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)腫瘤血管生成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可特異性抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、增殖并誘導(dǎo)凋亡［14］。因VEGFR2 能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生成，天然成為抑制實(shí)體瘤生長(zhǎng)的靶標(biāo)，阻斷VEGF/VEGFR2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可謂抗癌過(guò)程中的重要策略［15-16］。Akt 為VEGFR2 下游效應(yīng)因子，可在不同信號(hào)刺激下經(jīng)磷酸化誘導(dǎo)下游靶點(diǎn)，刺激腫瘤細(xì)胞生成［17-18］。Akt 是PI3K/Akt 信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要激酶，被上游激酶激活后，進(jìn)入細(xì)胞核磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等細(xì)胞行為［19-20］。本研究結(jié)果顯示：隨著熟地黃多糖處理濃度增加，PC-3 細(xì)胞中VEGFR2、p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)，有明顯濃度依賴性，提示熟地黃多糖可能通過(guò)抑制VEGF/Akt 信號(hào)通路發(fā)揮抗前列腺癌的作用。

綜上所述，熟地黃多糖對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞有抑制增殖、侵襲以及誘導(dǎo)凋亡的作用，可能通過(guò)抑制VEGF/Akt 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。本次研究成果豐富了關(guān)于中藥治療雄激素非依賴性前列腺癌的報(bào)道，有一定參考價(jià)值。但前列腺癌PC-3 細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡可能受多條信號(hào)通路調(diào)控，本研究不足之處在于僅完成了VEGF/Akt 信號(hào)通路研究，且局限于雄激素非依賴性前列腺癌的治療，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行其他相關(guān)通路研究，不斷完善熟地黃多糖抗前列腺癌PC-3 細(xì)胞的具體機(jī)制方面研究，為中醫(yī)藥治療前列腺癌提供新道路。