張震 王梅芳 宋遠(yuǎn)見

1徐州醫(yī)科大學(xué)遺傳學(xué)學(xué)科（江蘇徐州221004）；2徐州市醫(yī)學(xué)遺傳與工程研究中心（江蘇徐州221004）；3常熟市第二人民醫(yī)院麻醉科（江蘇常熟215500）

缺血性腦卒中是一種常見的腦血管病，是造成患者死亡和殘疾的主要原因［1］。缺血性腦卒中發(fā)作后，在梗死核心區(qū)會(huì)造成相應(yīng)的神經(jīng)元及腦血管損傷，進(jìn)而導(dǎo)致腦內(nèi)環(huán)境紊亂，影響相應(yīng)腦區(qū)的功能［2］。卒中后常伴隨著焦慮行為［3］，該行為與杏仁核的損傷關(guān)系密切。如今，焦慮已經(jīng)成為卒中后最主要的神經(jīng)精神病之一，影響著卒中后神經(jīng)功能康復(fù)［4］。而JNK 和p38 MAPK 信號(hào)通路在焦慮樣行為調(diào)控以及腦缺血后細(xì)胞損傷進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用［5-6］。瞬時(shí)受體電位香草酸1（TRPV1），在神經(jīng)元及腦內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)。已有研究報(bào)道，TRPV1 在腦缺血后激活并造成神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)功能缺陷［7］。抑制TRPV1 還能減輕外傷性腦損傷后的血腦屏障破壞［8］。這表明TRPV1 在缺血性腦損傷以及血腦屏障損傷中起到重要的調(diào)節(jié)作用。腦缺血后TRPV1 是否會(huì)通過調(diào)控JNK 和p38 MAPK 信號(hào)通路影響腦血管通透性并改變焦慮樣行為尚未明確。探明該問題，對(duì)于尋找新的藥物靶點(diǎn)和治療腦缺血后的焦慮情緒，減輕血腦屏障損傷具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑Capsazepine（Sigma 公司）、HE 試劑盒（中國(guó)碧云天公司）、CD31 抗體（Abcam 公司）、Claudin5 抗體（Invitrogen 公司）、DAPI 染色液（中國(guó)碧云天公司）、p-JNK（Santa Cruz 公司）、p-p38 MAPK（CST 公司）、BCA 試劑盒（中國(guó)碧云天公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物7 ～8 周齡SPF 級(jí)C57BL6/J 雄性小鼠54只，體質(zhì)量22 ～24 g，分為假手術(shù)組（Sham）、缺血再灌注組（I/R）、缺血再灌注+抑制劑組（I/R+CPZ）。小鼠由山東濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（魯）2019 0003。實(shí)驗(yàn)過程中針對(duì)所有小鼠實(shí)驗(yàn)操作均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指導(dǎo)原則，實(shí)驗(yàn)后小鼠均深度麻醉后脫臼處死。

1.3 小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型制作采用線栓法構(gòu)建MCAO 模型，缺血1 h，再灌注24 h。術(shù)前將小鼠禁食12 h，麻醉小鼠后，沿頸部正中線切開皮膚，分離右側(cè)的頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈。將線栓從頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，進(jìn)而進(jìn)入大腦中動(dòng)脈。當(dāng)插線栓的過程中遇到輕微阻力時(shí)，立即停止插線栓，待缺血1 h 后，將線栓緩慢退出。

1.4 側(cè)腦室注射在術(shù)前30 min 側(cè)腦室注射TRPV1抑制劑CPZ（7.50 μg/3 μL每只）。以Bregrma點(diǎn)為原點(diǎn)，定位右側(cè)腦室位置（位于Bregrma 點(diǎn)向后0.50 mm，旁開1.00 mm，深2.20 mm），并用記號(hào)筆標(biāo)記，然后用顱骨鉆鉆孔。用微量注射器吸取3 μL CPZ，注射時(shí)間持續(xù)7 min，然后留針10 min后緩慢退針。縫合并消毒皮膚，將小鼠放入保溫箱中飼養(yǎng)。

1.5 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用小鼠共36 只。實(shí)驗(yàn)前讓小鼠適應(yīng)15 min，使用75%酒精清理迷宮內(nèi)部。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將小鼠提起放置于中央?yún)^(qū)域，保持其頭朝開放臂。小鼠進(jìn)入開放臂或封閉臂的條件以四只爪子進(jìn)入該臂區(qū)域?yàn)闇?zhǔn)。實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)保持安靜。每次實(shí)驗(yàn)后同樣用酒精擦拭迷宮。實(shí)驗(yàn)過程中使用Anymaze 行為學(xué)分析軟件對(duì)小鼠活動(dòng)進(jìn)行記錄。

1.6 HE 染色實(shí)驗(yàn)用小鼠共9 只。小鼠缺血再灌注24 h 后心臟灌流，然后斷頭取腦，使用冰凍切片機(jī)切片，厚度20 μm。樣本用蘇木精染色，然后1%鹽酸酒精分化，返藍(lán)，伊紅染色，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于400×視野下觀察。

1.7 免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)所用樣本與HE 染色為同一批樣本。實(shí)驗(yàn)前將腦片室溫放置30 min 復(fù)溫。將山羊血清滴加到腦片上，封閉2 h。棄去血清，將Claudin5 一抗按比例（1∶300）稀釋，覆蓋腦片，4 ℃冰箱過夜。PBS 洗滌5 min，3 次。將二抗按比例（1∶500）稀釋，覆蓋腦片，室溫孵育2 h。棄去二抗，PBS 洗滌5 min，3 次。DAPI 染色液染核10 min，棄去染色液，PBS 洗滌5 min，3 次。封片后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.8 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)用小鼠共9 只。小鼠缺血再灌注24 h 后處死，取小鼠腦組織提取總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到NC 膜上，置于5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后加入需要檢測(cè)蛋白的一抗、二抗，TBST 洗凈，于奧德賽蛋白顯影儀下顯影，進(jìn)行半定量計(jì)算。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 21.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料之間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制TRPV1 能夠減輕小鼠腦缺血后焦慮樣行為為了檢測(cè)小鼠腦缺血后的焦慮樣行為，在小鼠腦缺血再灌注7 d 后進(jìn)行高架十字迷宮檢測(cè)（圖1）。結(jié)果顯示，與I/R組比較，I/R+CPZ組小鼠在開臂的移動(dòng)距離和停留時(shí)間顯著增加（P＜0.001），表明抑制TRPV1 可減輕小鼠腦缺血再灌注后焦慮樣行為。

圖1 CPZ 減輕造模后小鼠焦慮樣行為Fig.1 CPZ reduces anxiety-like behavior in mice after MCAO

2.2 抑制TRPV1 能夠減輕小鼠腦缺血后病理損傷、組織水腫在小鼠再灌注24 h 后，通過HE 染色觀察小鼠杏仁核腦區(qū)病理損傷狀況（圖2）。HE染色結(jié)果顯示：相較于I/R 組，I/R+CPZ 組胞質(zhì)著色變深，細(xì)胞核固縮減少，表明抑制TRPV1 減輕小鼠腦部病理損傷。

圖2 Capsazepine 減輕小鼠腦病理損傷、組織水腫（×400）Fig.2 CPZ reduces brain pathological damage and tissue edema in mice（×400）

2.3 抑制TRPV1 能夠減輕小鼠腦缺血后杏仁核區(qū)腦血管損傷為了檢測(cè)小鼠腦血管損傷情況，在小鼠再灌注24 h后進(jìn)行了免疫熒光染色（圖3）。結(jié)果顯示，與I/R 組比較，I/R+CPZ 組Claudin5 表達(dá)量增加，表明抑制TRPV1 可減輕小鼠腦血管損傷。

圖3 抑制TRPV1 能夠減輕小鼠腦缺血后杏仁核區(qū)腦血管損傷Fig.3 Inhibition of TRPV1 can alleviate cerebral vascular injury in amygdala after cerebral ischemia in mice

2.4 抑制TRPV1降低腦缺血后p-JNK、p38 MAPK水平為了探討TRPV1對(duì)JNK和p38 MAPK信號(hào)通路的影響，通過免疫印記檢測(cè)了小鼠再灌注24 h后p-JNK、p-p38MAPK的蛋白水平。對(duì)條帶進(jìn)行分析后得出了蛋白的相對(duì)表達(dá)量（圖4）。結(jié)果表明，與I/R組比較，I/R+CPZ 組小鼠p-JNK、p-p38 MAPK 水平降低（P＜0.05），表明抑制TRPV1 降低了腦缺血后p-JNK、p-p38MAPK蛋白水平。

圖4 CPZ 減少p-JNK、p-p38 MAPK 蛋白水平Fig.4 CPZ reduces p-JNK，p-p38 MAPK protein levels

3 討論

全世界每年有將近1 700 萬人患腦卒中，其中30%～35%患者死亡，剩下的患者也存在運(yùn)動(dòng)以及精神障礙等后遺癥［9］。焦慮和抑郁已經(jīng)成為卒中后兩大主要的精神病，臨床數(shù)據(jù)表明25%的卒中患者都伴隨著焦慮癥狀［10-11］。TRPV1 在缺血性腦卒中后起到病理性作用［7］，但TRPV1 對(duì)腦缺血后血腦屏障和焦慮樣行為的作用還未見報(bào)道，因此本研究選擇TRPV1 作為研究靶點(diǎn)，以期能夠探明TRPV1 在缺血性腦卒中后對(duì)血腦屏障和焦慮樣行為的作用。

本研究中，高架十字迷宮結(jié)果表明I/R+CPZ 組小鼠較I/R組小鼠在開臂的移動(dòng)距離和停留時(shí)間顯著增加，表明抑制TRPV1能夠減少小鼠腦缺血后焦慮樣行為。在MARSCH等［12］的研究中，TRPV1 敲除鼠表現(xiàn)出更少的焦慮樣行為。SRIVASTAVA［13］研究表明抑制P2X4 受體減輕腦缺血誘導(dǎo)的焦慮樣行為，本研究結(jié)果與其一致。目前認(rèn)為腦杏仁核區(qū)與焦慮樣行為的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，CHEN 等［14］研究表明，杏仁核給藥能減輕外周神經(jīng)損傷后焦慮樣行為的發(fā)展。本研究通過HE 染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，I/R組小鼠杏仁核腦區(qū)細(xì)胞受損現(xiàn)象嚴(yán)重，大量細(xì)胞核呈核固縮形態(tài)。在抑制TRPV1 后，細(xì)胞損傷減少，細(xì)胞核形態(tài)改善。

腦卒中后常見的一個(gè)病理特征是血腦屏障的破壞［15］，而腦血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的破壞是腦卒中后血管通透性升高的主要原因［16］。在正常大鼠中，使用激動(dòng)劑激活TRPV1 本身就會(huì)導(dǎo)致血腦屏障的破壞［17］。YANG 等［8］的研究也表明抑制TRPV1 能減輕外傷性腦損傷后的血腦屏障破壞，而本實(shí)驗(yàn)表明，在缺血性腦卒中后，抑制TRPV1 能夠減輕緊密連接蛋白Claudin5 的表達(dá)，表明在腦缺血后，TRPV1 也是血腦屏障破壞的原因之一。

JNK 和p38 MAPK 通路在腦缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中具有重要的作用，有研究表明鈣離子敏感受體在小鼠腦缺血后通過激活JNK 和p38 MAPK信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡［18］。在LIU 等［19］的研究中也表明，抑制TRPV1 能減少JNK 的激活。TRPV1作為親鈣離子型離子通道蛋白，因此筆者推測(cè)TRPV1 可能通過JNK 和p38 MAPK 信號(hào)通路調(diào)控腦缺血損傷。本研究中免疫印跡結(jié)果也已經(jīng)證明抑制TRPV1 能降低p-JNK、p-p38 MAPK 的蛋白水平，表明TRPV1 可能通過JNK 和p38 MAPK 通路調(diào)節(jié)腦缺血后的焦慮樣行為以及血腦屏障損傷。

TRPV1 在缺血性腦卒中的病理作用已有報(bào)道，然而具體的損傷機(jī)制以及在缺血性腦卒中后TRPV1 對(duì)焦慮樣行為和血腦屏障的作用還未見報(bào)道。本研究證明了抑制TRPV1 可以降低小鼠腦缺血后p-JNK、p-p38 MAPK 的蛋白水平，減少腦缺血誘導(dǎo)的緊密連接蛋白Claudin5 的破壞，改善小鼠腦缺血誘導(dǎo)的焦慮樣行為。目前對(duì)于缺血再灌注損傷的治療方法還比較少，預(yù)缺血處理治療心臟缺血的方法之一，但對(duì)腦缺血來說還比較危險(xiǎn)［20］。本研究結(jié)果表明抑制TRPV1 可通過干擾JNK 和p38 MAPK 信號(hào)通路減少腦缺血后焦慮樣行為及血管損傷，為缺血性腦損傷的治療提供了新的靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而TRPV1 屬于離子通道蛋白，最能反映其活性的應(yīng)該是電生理實(shí)驗(yàn)檢測(cè)通道周圍膜電勢(shì)，本研究還未進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。而且本研究涉及的損傷機(jī)制尚比較淺薄，需要進(jìn)一步研究。