楊 穎,胡 家,張 悅

(1首都醫(yī)科大學(xué)中心實驗室,北京 100069;2首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系;*通訊作者,E-mail:yy9358@qq.com)

腎癌(RCC)是最常見的腎臟惡性腫瘤,約占成人惡性腫瘤的2%。其中,腎透明細胞癌(ccRCC)是最常見的亞型,占所有腎癌病例的75%[1]。20%-30%的患者在初診時就被診斷為局部進展性或轉(zhuǎn)移性ccRCC。雖然外科切除術(shù)是局限性ccRCC患者的有效治療手段,約30%的患者仍然會在術(shù)后15-18個月出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移,進展性ccRCC患者的5年生存率低于10%[2,3]。近年多項研究表明ccRCC的發(fā)生與酪氨酸激酶受體和mTOR信號通路的過度激活相關(guān)聯(lián),相應(yīng)的靶向治療雖然提高了晚期患者的生存率,但是療效有限,僅有10%-30%的患者達到完全或部分緩解[4]。因此,尋找和發(fā)現(xiàn)有預(yù)測價值的生物標記物對于指導(dǎo)ccRCC的精準治療具有重要的意義。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)PDZ蛋白NHERF3在ccRCC組織中表達水平明顯下調(diào),并且多因素分析結(jié)果提示NHERF3可以作為ccRCC患者生存的獨立預(yù)后因子[5]。在研究過程中,我們采用了iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)、免疫組化和Western blot等技術(shù)對ccRCC組織中的NHERF3蛋白進行定量分析,這些方法均需要對樣品進行直接或間接標記,操作步驟繁瑣,實驗周期長,并且無法實現(xiàn)對腫瘤組織樣品中NHERF3濃度的定量分析。表面等離子共振(SPR)是無標記定量分析生物分子間相互作用的技術(shù),近年來,SPR技術(shù)也應(yīng)用于復(fù)雜樣品成分的定量研究[6-8],為此,本次實驗擬采用SPR技術(shù)建立無標記定量檢測ccRCC組織中NHERF3蛋白濃度的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 CM5傳感芯片、HBS-EP+、氨基偶聯(lián)試劑、NSB reducer試劑、200 mmol/L NaOH、GST-PreScission蛋白酶以及GSTrapTMFF蛋白純化柱購自美國GE Healthcare公司;抗NHERF3抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;牛血清白蛋白BSA購自美國Sigma公司;BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Fisher公司。

1.1.2 儀器 Biacore T200分子互作分析儀,美國GE Healthcare公司;UltrafleXtreme質(zhì)譜儀,美國BRUKER公司;EnVision多標記讀板儀,美國PerkinElmer公司。

1.2 方法

1.2.1 NHERF3重組蛋白的表達、純化和鑒定 GST融合蛋白GST-NHERF3在大腸桿菌BL21內(nèi)誘導(dǎo)表達,利用GST蛋白純化柱進行親和層析獲得純化的GST融合蛋白,用GST-PreScission蛋白酶將GST標簽從融合蛋白上分離。用SDS-PAGE電泳法檢測蛋白的表達情況和純度,采用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析法鑒定純化蛋白,利用BCA比色法檢測蛋白質(zhì)的濃度。

1.2.2 腎組織蛋白的提取 腎癌患者的癌和癌旁組織經(jīng)機械研磨,稱取大約10 mg的組織,加入500 μl裂解液(內(nèi)含pH 7.0的50 mmol/L HEPES,150 mmol/L NaCl,1% Triton X-100,1 mmol/L EGTA,蛋白酶抑制劑),在4 ℃下裂解30 min,進行離心和上清收集,重復(fù)3次,檢測蛋白質(zhì)的濃度,用裂解液將濃度調(diào)整至1 mg/ml備用。

1.2.3 抗NHERF3抗體與NHERF3相互作用親和力的檢測 以HBS-EP緩沖液(內(nèi)含pH 7.4的10 mmol/L HEPES,150 mmol/L NaCl,3 mmol/L EDTA,0.05% P20)作為運行緩沖液,將抗NHERF3抗體用pH 4.5的10 mmol/L醋酸鈉溶液稀釋至50 μg/ml的濃度,采用氨基偶聯(lián)法固定在CM5芯片上,最終達到1 500 RU左右的固定水平。用HBS-EP高流速沖洗芯片直至基線穩(wěn)定。將純化的NHERF3重組蛋白分別稀釋至0.78,1.56,3.12,6.25,12.5,25,50 nmol/L,采用動力學(xué)分析Wizard模板中的kinetics/affinity程序進行動力學(xué)實驗,以30 μl/min的流速進樣,結(jié)合時間和解離時間分別設(shè)為120 s和240 s,每個分析循環(huán)結(jié)束后,用4 mmol/L NaOH再生芯片,將剩余的NHERF3蛋白從芯片表面完全洗脫,再生時間設(shè)為30 s。用Biacore T200分析軟件擬合所得數(shù)據(jù)。此檢測過程中將BSA蛋白作為陰性對照,倍比稀釋濃度梯度為3.125,6.25,12.5,25,50,100 μmol/L,進樣和再生程序設(shè)置均參照NHERF3蛋白。

1.2.4 NHERF3標準曲線的建立 將HBS-EP緩沖液作為運行緩沖液,按照1.2.3的方法將抗NHERF3抗體固定在CM5芯片上,偶聯(lián)水平最終達到12 000 RU左右。將NHERF3重組蛋白用含10% NSB reducer的緩沖液稀釋至終濃度為0.062 5,0.125,0.25,0.5,1,2,3,4,5,6,8 μg/ml,采用Method模板中的concentration test程序,以5 μl/min的流速進樣,結(jié)合時間和解離時間分別設(shè)為300 s和240 s,用5 mmol/L NaOH作為再生液,再生時間設(shè)為60 s。響應(yīng)信號報告點設(shè)在進樣結(jié)束后10 s。

1.2.5 腎癌組織中NHERF3蛋白的定量檢測 將20對腎透明細胞癌和對應(yīng)的癌旁組織蛋白提取液作為分析物,采用1.2.4的進樣程序,依次流過高水平偶聯(lián)抗NHERF3抗體的芯片,記錄結(jié)合反應(yīng)值并畫到標準曲線上計算NHERF3的濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 重組NHERF3蛋白純化和質(zhì)譜鑒定的結(jié)果

SDS-PAGE檢測表達純化的重組蛋白的分子量為100 kD左右,接近預(yù)測的GST-NHERF3分子量大小,純度可達到95%以上。為了避免GST標簽對NHERF3與抗NHERF3抗體相互作用的影響,利用PreScission蛋白酶將融合蛋白的GST標簽完全分離,根據(jù)SDS-PAGE檢測結(jié)果初步判斷蛋白混合物主要由NHERF3、PreScission蛋白酶和GST蛋白組成。再次用GST柱進行親和純化,即獲得純度達95%,分子量為70 kD左右的蛋白(見圖1)。進一步用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析法進行鑒定,二級譜圖匹配結(jié)果證實該蛋白為NHERF3(見圖2)。

1.純化GST-NHERF3的表達;2.preScission蛋白酶消化后的NHERF3和GST的表達;3.二次純化后NHERF3的表達圖1 SDS-PAGE檢測重組NHERF3蛋白的表達Figure 1 Validation of recombinant NHERF3 expression by SDS-PAGE

圖2 純化的NHERF3的二級質(zhì)譜圖Figure 2 MS2 spectrum for purified NHERF3 protein

2.2 抗NHERF3抗體與NHERF3相互作用特異性的檢測

為了研究抗NHERF3抗體是否特異性結(jié)合NHERF3,我們將抗NHERF3抗體固定在芯片的反應(yīng)通道Fc2上,Fc1作為參比通道,將重組NHERF3蛋白倍比稀釋成7個濃度梯度,依次流過芯片表面。Fc2響應(yīng)值扣減Fc1響應(yīng)值后動力學(xué)分析結(jié)果顯示,抗NHERF3抗體與NHERF3相互作用的結(jié)合速率常數(shù)Ka為(1.188±0.005 1)×105(mol/L)-1·s-1,解離速率常數(shù)Kd為(2.34±0.007 5)×10-3s-1,親和力KD為19.7 nmol/L,提示二者的結(jié)合為強相互作用(見圖3A)。為了進一步證實該相互作用的特異性,我們將BSA作為陰性對照分析物,以同樣的方式流過芯片表面,由圖可見,即使蛋白濃度為NHERF3的4 000倍,BSA與抗NHERF3抗體亦無明顯相互作用(見圖3B)。

A.不同濃度NHERF3與抗NHERF3抗體相互作用的傳感圖B.不同濃度BSA與抗NHERF3抗體相互作用的傳感圖圖3 抗NHERF3抗體與NHERF3結(jié)合的特異性Figure 3 Specificity of NHERF3 binding to anti-NHERF3 antibody

2.3 檢測方法的靈敏性

為了最大限度地檢測出樣品中NHERF3的水平,與2.2不同,我們將抗NHERF3抗體高水平固定在芯片的反應(yīng)通道上,增大NHERF3的低濃度范圍,延長NHERF3的進樣時間至300 s,降低流速,同時,為了減少蛋白樣品與芯片葡聚糖基質(zhì)非特異性結(jié)合的影響,在樣品中加入10%的NSB reducer。將結(jié)合響應(yīng)值報告點設(shè)在進樣結(jié)束后,以排除樣品與運行緩沖液折光率差異的影響(見圖4A),用非線性回歸分析法擬合建立NHERF3標準曲線,統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示,空白樣品3次重復(fù)試驗產(chǎn)生的響應(yīng)值的標準差為0.071 RU,相對應(yīng)的NHERF3濃度值為2.707 ng/ml。由此,NHERF3蛋白的檢測限LOD和定量限LOQ分別為8.12 ng/ml和27.07 ng/ml(R2=0.99,見圖4B)。

A.不同濃度NHERF3與抗NHERF3抗體結(jié)合的傳感圖B.非線性回歸擬合的NHERF3標準曲線 (X標記為響應(yīng)信號報告點)圖4 SPR定量檢測方法的靈敏性Figure 4 Sensitivity of SPR quantitative methodology

2.4 檢測方法的可重復(fù)性

為了證實SPR定量檢測方法的可靠性,我們進一步研究了方法的可重復(fù)性。將NHERF3稀釋至8 μg/ml,流過高水平偶聯(lián)抗NHERF3抗體的芯片表面,反復(fù)運行50次檢測循環(huán)(進樣300 s、解離240 s和再生60 s)(見圖5A)。NHERF3蛋白樣品(前33和后17個進樣)被分置于2個獨立的樣品瓶。由圖5B可見,結(jié)合響應(yīng)值在1-10循環(huán)有緩慢上升趨勢,在11-42循環(huán)維持相對穩(wěn)定狀態(tài),至43-50循環(huán)有明顯下降趨勢,提示抗NHERF3抗體的結(jié)合活性逐漸降低。50個檢測循環(huán)結(jié)合響應(yīng)值的變異系數(shù)為4.25%。

A.50個NHERF3(8 μg/ml)檢測循環(huán)的覆蓋圖B.NHERF3注入后Fc2通道上結(jié)合響應(yīng)信號的散點圖圖5 SPR定量檢測方法的可重復(fù)性Figure 5 Repeatability of SPR quantitative methodology

2.5 腎癌和癌旁組織中NHERF3蛋白表達水平差異性分析

由于個體之間NHERF3的表達水平的差異較大,我們?nèi)?次檢測結(jié)果的均值采用成對t檢驗,比較20對腎癌和癌旁組織中NHERF3的表達水平。結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,腎癌組織中NHERF3表達水平明顯下調(diào)[(36.4±54.38)ng/μlvs(155.1±60.47)ng/μl,P<0.001,見圖6]。

圖6 腎癌和癌旁組織NHERF3表達水平的分析Figure 6 Analysis of NHERF3 expression in ccRCC and adjacent renal tissues

3 討論

NHERF3又稱PDZK1,是鈉氫交換調(diào)控因子(NHERF)家族中的一員。NHERF3是含有4個PDZ結(jié)構(gòu)域的支架蛋白,主要表達在腎臟、胃腸道和肝臟等組織的上皮細胞[9]。研究表明NHERF3通過與多種轉(zhuǎn)運體結(jié)合在維持水電解質(zhì)平衡和藥物轉(zhuǎn)運方面發(fā)揮潛在的作用[10-12]。同時,最近研究發(fā)現(xiàn),NHERF3還可以與一些腫瘤相關(guān)蛋白如PTEN、EGFR和SHP-1相互作用,調(diào)控腎癌、胃癌和乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13-15]。而且,作為腎癌患者生存的獨立預(yù)后因子[5],NHERF3可能成為腎癌患者的個性化治療方案選擇的生物標記物。

近年來隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展,生物標記物的鑒定和檢測已成為該領(lǐng)域研究的熱點。其中,腫瘤相關(guān)生物標記物的檢測在疾病的早期診斷、預(yù)防、預(yù)后的評估以及治療方案的選擇中發(fā)揮著重要的作用。然而,由于生物標記物濃度低以及復(fù)雜基質(zhì)背景的影響從而增加了檢測的難度,因此,有必要建立快速、高靈敏度和高精確度的特異性定量檢測方法[16]。

我們之前的研究采用了iTRAQ標記質(zhì)譜定量技術(shù)檢測腎癌組織中NHERF3的水平[5],由于NHERF3蛋白在個體腎癌組織中豐度偏低,因此我們將同一分期的患者的樣本合并后進行檢測,因此無法獲得單個腫瘤樣本中NHERF3表達的信息。在本研究中,我們采用SPR技術(shù),選擇與NHERF3蛋白具有強特異性結(jié)合的抗體,經(jīng)檢測,KD達到nmol/L級別。為了提高檢測的靈敏度,我們將抗體以最大的偶聯(lián)水平固定在芯片上,使其能夠在限定的進樣時間內(nèi)捕獲盡可能多的NHERF3蛋白,對NHERF3蛋白的檢測限亦達到了ng/ml的水平,使得檢測個體樣本成為可能。此外,該檢測方法50次進樣循環(huán)的結(jié)合信號的變異系數(shù)遠低于分析學(xué)方法推薦的最大值15%[15],進一步提示了NHERF3定量檢測方法在連續(xù)多次檢測過程中具有較好的穩(wěn)定性。利用這種定量方法對20對腎癌和癌旁組織中NHERF3表達水平的比較分析結(jié)果顯示NHERF3的表達水平在腎癌組織中明顯下調(diào),與Western blot半定量分析方法獲得的結(jié)果一致[5]。

綜上所述,基于SPR技術(shù)的定量分析方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、無需標記的優(yōu)勢,可以應(yīng)用于腎癌臨床樣本的生物標記物中通量的定量檢測。