張 潮,尉志文,王錦凱,牛衛(wèi)芬,贠克明

(山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院毒化教研室,太原 030001;*通訊作者,E-mail:yunkeming4135142@126.com)

利多卡因(lidocaine)又名利多卡因堿、賽羅卡因、昔羅卡因,分子式是C14H22N2O,屬于酰胺類堿性中效局麻藥,具有彌散廣、穿透性強的特點,尤其是其非離子型式對生物膜的穿透力更強,容易發(fā)生彌散[1]。在肝臟內(nèi)經(jīng)CYP3A2和CYP1A2兩種酶代謝生成單乙基甘氨酰二甲苯胺(monoethylglycinexylidide,MEGX)和甘氨二甲基苯酰胺(glycinexylidide,GX)[2],經(jīng)腎臟排出體外。硬膜外麻醉是我國臨床手術(shù)常用的麻醉方式,利多卡因則為椎管內(nèi)麻醉的首選用藥之一。手術(shù)過程中常會因椎管的特殊解剖生理結(jié)構(gòu),麻醉醫(yī)師的操作熟練程度以及病人自身的身體狀態(tài)等多種影響因素,導(dǎo)致硬膜外麻醉意外的事故時有發(fā)生[3,4],硬膜外麻醉意外的法醫(yī)學(xué)鑒定依賴于利多卡因及其代謝物的檢測,以及其法醫(yī)毒物動力學(xué)的規(guī)律研究[5]。目前在生物檢材中能同時檢測利多卡因、MEGX和GX的方法還未見報道。本研究旨在通過建立硬膜外注射利多卡因麻醉致死的動物模型[6,7]和LC-LIT-MS檢測利多卡因及其代謝產(chǎn)物的方法,為硬膜外麻醉意外的法醫(yī)學(xué)判定提供方法支持。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑

利多卡因標(biāo)準(zhǔn)品(100342-201003)購自中國藥品生物制品檢定所,地西泮標(biāo)準(zhǔn)品購自公安部物證鑒定中心,MEGX標(biāo)準(zhǔn)品購自北京迪朗生化科技有限公司(N1006),GX標(biāo)準(zhǔn)品(購自美國Sigma公司),以上試劑均配成濃度為10 μg/ml儲備液,4 ℃冰箱保存。2%鹽酸利多卡因注射液(國藥準(zhǔn)字H31021071)購自上海朝暉藥業(yè)有限公司,其余試劑均為色譜純。

1.2 模型制備

犬6只(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供),體質(zhì)量(9.6±2.1)kg,雌雄不限,隨機分為模型組和空白組,實驗前夜禁食,左側(cè)臥位固定于犬臺上,剪去實驗犬背部胸椎到骶椎處長毛,行腰椎L2-L3間穿刺,穿刺針與脊椎平面成45°,回抽針管有負壓且無腦脊液流出,證明穿入硬膜外后,向頭側(cè)置硬腦膜導(dǎo)管10 cm,5倍(63.35 mg/kg)[8]硬膜外麻醉極量利多卡因在5 min內(nèi)緩慢注入。觀察并記錄實驗犬呼吸、心跳等生命體征,至死亡后解剖觀察。空白組注入等量生理鹽水,1 h后股靜脈空氣栓塞致死,取心血和肝臟-20 ℃保存用作空白檢材。本研究通過山西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審查(編號：2014087)。

1.3 樣品處理

分別將肝臟1 g(超聲勻漿3 min)、心血1 ml,加蒸餾水2 ml后加安定內(nèi)標(biāo)液10 μl,振蕩5 min;10%HCl調(diào)酸pH=2-3,振蕩15 min,3 500 r/min離心6 min,取上清液,用10%NaOH調(diào)堿pH=10-12,震蕩3 min,加乙醚10 ml,振蕩15 min,3 500 r/min離心6 min,取有機層,40 ℃水浴揮干。殘渣用500 μl甲醇定容,待檢。

1.4 儀器及分析條件

Ultimate 3000雙三元梯度液相色譜,LTQ-XL線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo fisher),ESI電噴霧離子源和Xcalibur工作站,TOMOS-18R高速冷凍離心機,超聲波震蕩器。

液相色譜條件:左泵A流動相為超純水,左泵B流動相為0.1%甲酸的甲醇溶液,左泵C流動相為洗針液(20%超純水+80%甲醇+0.2%甲酸);右泵A1流動相為緩沖液(0.01 mol/L乙酸銨水溶液+0.1%甲酸),右泵B1流動相為0.1%甲酸的甲醇溶液,右泵C1流動相為超純水。色譜柱為C18柱(3.0 mm×100 mm,120 ?,2.2 μm),柱溫40 ℃。流速0.4 ml/min;進樣量50 μl。質(zhì)譜條件:采用正離子選擇監(jiān)測(SIM)掃描,利多卡因、MEGX、GX測定離子對分別為235/86.1/58,207/122/107和179/122/107,毛細管電壓38 V,毛細管溫度275 ℃,棱鏡電壓85 V,鞘氣35 arb,輔助氣15 arb,碰撞氣為高純氦氣,脫溶劑氣為高純氮氣,掃描范圍m/z:110-500。50 μl進樣。

2 結(jié)果

2.1 動物表現(xiàn)及解剖所見

經(jīng)硬膜外注射利多卡因后,實驗犬出現(xiàn)心率減慢、流涎、呼吸急促呈腹式呼吸、大小便失禁和抽搐等癥狀,犬于20 min后死亡。實驗犬解剖后可見心臟及大血管內(nèi)血液不凝呈暗紅色無雞脂樣血塊形成,肺、肝、腎、脾等器官輕度腫脹,心、肺漿膜面有出血點。解剖見穿刺部位小孔和麻醉導(dǎo)管進入硬膜外的位置(見圖1,2),提示造模成功。

圖1 實驗犬下導(dǎo)管插入椎管位置Figure 1 The location of catheter in model dog

圖2 實驗犬導(dǎo)管插入硬膜外的位置Figure 2 The location of the duramater catheter in model dog

2.2 質(zhì)譜圖分析結(jié)果

在正離子選擇監(jiān)測(SIM)掃描模式出現(xiàn)利多卡因、MEGX及GX的特征離子對,并且離子豐度比均在允許的誤差范圍內(nèi)(見圖3-8)。

圖3 利多卡因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖Figure 3 The mass spectrum of lidocaine

圖4 利多卡因二級質(zhì)譜圖Figure 4 The secondary mass spectrum of lidocaine

圖5 MEGX標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖Figure 5 The mass spectrum of MEGX

圖6 MEGX二級質(zhì)譜圖Figure 6 The secondary mass spectrum of MEGX

圖7 GX標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)質(zhì)譜圖Figure 7 The mass spectrum of GX

圖8 GX二級質(zhì)譜圖Figure 8 The secondary mass spectrum of GX

2.3 色譜圖分析

染毒心血和肝臟的色譜圖中均出現(xiàn)利多卡因、MEGX和GX的色譜峰;LC-LIT-MS總離子流和選擇離子色譜圖見圖9,10。

利多卡因、MEGX和GX的保留時間分別為6.81,6.55,6.43 min圖9 硬膜外致死犬血中利多卡因、MEGX和GX的總離子流和選擇離子色譜圖Figure 9 The total-ion and selected-ion chromatograms of lidocaine, MEGX and GX in poisoned blood

利多卡因、MEGX和GX的保留時間分別為5.73,5.95,5.61 min圖10 硬膜外致死犬肝臟中利多卡因、MEGX和GX的LC-LIT-MS總離子流和選擇離子色譜圖Figure 10 The total-ion and selected-ion chromatograms of lidocaine, MEGX and GX in poisoned liver

2.4 工作曲線

取空白血1 ml和肝組織勻漿1 g各10份,分別加入利多卡因、MEGX和GX標(biāo)準(zhǔn)液0.1,0.5,1,5,10,20,50,100,200,250 ng,內(nèi)標(biāo)液10 μl,按1.3項處理,液相色譜-離子肼質(zhì)譜分析。以樣品中利多卡因、MEGX和GX的濃度為Y軸,與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為X軸,進行線性回歸,得到相關(guān)系數(shù)、檢出限和響應(yīng)范圍,結(jié)果均能夠滿足定量檢測的要求(見表1)。

表1 利多卡因、MEGX和GX的工作曲線

2.5 方法回收率

取空白血1 ml和空白肝臟1 g各3份,分別加入4 ng、20 ng、50 ng利多卡因、MEGX和GX,按1.3樣品處理后進樣,測定結(jié)果見表2和表3,回收率偏差均小于15%,方法穩(wěn)定性好。

表2 利多卡因、MEGX和GX在心血中的回收率 (n=3,%)

表3 利多卡因、MEGX和GX在肝臟中的回收率 (n=3,%)

3 討論

法醫(yī)毒物動力學(xué)(forensic toxicokinetics)[5]是運用法醫(yī)毒理學(xué)和法醫(yī)毒物動力學(xué)理論和技術(shù)探究機體、尸體、檢材和自然環(huán)境中法醫(yī)毒物的動力學(xué)變化過程的一門學(xué)科。其研究內(nèi)容主要包括毒物的毒物動力學(xué)、死后分布、動態(tài)分布、死后再分布、死后彌散、分解動力學(xué)、檢材和尸體中毒物的死后產(chǎn)生情況等,為中毒案件的法醫(yī)學(xué)鑒定提供毒物動力學(xué)證據(jù)。

本實驗建立了硬膜外麻醉致死犬體內(nèi)利多卡因及其代謝物MEGX和GX的LC-LIT-MS檢測方法,樣品處理簡單方便,重復(fù)性好,目標(biāo)物色譜峰分離良好,檢出限低,回收率高;可用于對利多卡因及其代謝物的法醫(yī)毒物動力學(xué)研究,以及利多卡因麻醉意外和相關(guān)中毒案件的法醫(yī)學(xué)鑒定。