劉偉棟,馮 峰

(河北省兒童醫(yī)院普外二科,石家莊 050000;*通訊作者,E-mail:feng2326@163.com)

炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases,IBD)是一種復(fù)雜的非特異性慢性、進(jìn)行性、免疫介導(dǎo)的炎癥性腸道疾病,在過去40年內(nèi),IBD的發(fā)病率逐年上升,發(fā)病年齡逐漸變小[1]。IBD在幼兒時期的發(fā)病較為罕見,但最近的研究也表明,0-5歲兒童IBD的發(fā)病率上升幅度較成年人更大[2]。IBD包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎兩大類[3],克羅恩病多發(fā)于結(jié)腸及小腸末端,臨床表現(xiàn)為腹痛、深腸黏膜潰瘍,多伴有腸道狹窄,潰瘍性結(jié)腸炎則主要發(fā)生于結(jié)腸及直腸,臨床表現(xiàn)為黏液性膿血便、腹瀉、腸黏膜潰瘍較淺,極少出現(xiàn)腸道狹窄[4]。IBD的發(fā)病與遺傳易感宿主對環(huán)境因素的免疫反應(yīng)失調(diào)有關(guān),抗生素的大量使用、飲食結(jié)構(gòu)的改變、寄生蟲感染、食用含有乳化劑及表面活性劑等因素導(dǎo)致腸道微生物及菌群的失衡和改變,最終引發(fā)IBD[5]。IBD患者廣泛存在營養(yǎng)不良的狀況,患者對能量和蛋白質(zhì)的需求量激增,常規(guī)營養(yǎng)支持無法滿足IBD患者的需求[6]。腸內(nèi)營養(yǎng)(enteral nutrition,EN)對于兒童IBD患者的腸黏膜功能的保護(hù)作用已經(jīng)被大量的研究所證實[7],腸內(nèi)免疫微生態(tài)營養(yǎng)(enteral ecoimmunonutrition,EIN)是近些年來新發(fā)現(xiàn)的營養(yǎng)支持方式[8],本實驗采用EIN對IBD模型幼鼠進(jìn)行干預(yù),觀察其對幼鼠腸黏膜損傷的影響及其調(diào)控機(jī)制,旨在為IBM患兒的臨床治療提供更多數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonic acid,TNBS)購自美國Sigma公司,批號:P2297。麻醉劑戊巴比妥鈉片購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司,批號:F20020915。腸內(nèi)營養(yǎng)混懸液(能全力)購自紐迪希亞制藥(無錫)有限公司,批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H20030012。雙歧桿菌三聯(lián)活菌購自上海信誼藥廠有限公司,批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字S10950032。谷氨酰胺顆粒購自成都力思特制藥股份有限公司,批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H20040245。精氨酸購自湖北省潛江市四維氨基酸有限公司,批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H20058540。兔單多克隆IL-17A一抗購自abcam公司,貨號:ab79056。

1.2 實驗動物

40只4周齡SD級幼鼠,體質(zhì)量為60-80 g,購自南京大學(xué)實驗動物中心。將所有幼鼠置于溫度為25 ℃、空氣濕度為60%的無特殊病原體(specific pathogen free,SPF)級動物實驗中,給予充足的飲食和潔凈的水源,適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,將幼鼠按照完全隨機(jī)法分為對照組、模型組、EN組和EIN組,每組10只。對照組10只幼鼠僅進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng),其余30只SD幼鼠則采用TNBS誘導(dǎo)以構(gòu)建IBD模型。模型組10只幼鼠給予0.9%生理鹽水灌腸,EN組10只幼鼠給予常規(guī)腸內(nèi)營養(yǎng)劑,EIN組10只幼鼠則在腸內(nèi)營養(yǎng)基礎(chǔ)上給予免疫微生態(tài)營養(yǎng)支持。

1.3 IBD幼鼠模型的構(gòu)建

手術(shù)開始前對所有幼鼠禁食24 h,但不禁水,手術(shù)開始時采用麻醉劑戊巴比妥鈉片(30 mg/kg)腹腔注射,待麻醉成功后,先將直徑約為2 mm的塑料軟管從幼鼠肛門處插入8 cm以方便灌腸。模型組、EN組和EIN組幼鼠采用5%TNBS(20 mg/kg)緩沖液混合50%等量乙醇溶液進(jìn)行灌腸,對照組則用0.9%等量生理鹽水灌腸,持續(xù)灌腸20 s后使各組幼鼠保持倒立姿勢2 min,當(dāng)幼鼠表現(xiàn)為腹瀉、黏液血便,出現(xiàn)厭食及體質(zhì)量快速下降癥狀時視為IBD幼鼠模型構(gòu)建成功。

1.4 營養(yǎng)干預(yù)

待所有幼鼠手術(shù)后清醒6 h,對照組幼鼠提供充足的飲水,模型組、EN組和EIN組幼鼠則先以2 ml生理鹽水沖洗腸管后,對照組和模型組幼鼠給予常規(guī)普通飼料喂養(yǎng),EN組幼鼠給予125 kJ/kg腸內(nèi)營養(yǎng)混懸液(能全力),EIN組幼鼠在腸內(nèi)營養(yǎng)液基礎(chǔ)上同步給予109CFU雙歧桿菌三聯(lián)活菌、0.4 g/kg谷氨酰胺顆粒和0.25 g/kg精氨酸,持續(xù)喂養(yǎng)7 d,7 d后頸椎脫臼處死各組幼鼠,取結(jié)腸組織待用。

1.5 免疫組化檢測白細(xì)胞介素17A(interleukin 17A,IL-17A)水平

取1.4中各組幼鼠結(jié)腸組織,經(jīng)石蠟包埋后脫蠟處理,梯度乙醇水化后高溫高壓修復(fù),磷酸鹽平衡緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)沖洗后H2O2和山羊血清封閉,與兔多克隆IL-17A一抗(稀釋比1 ∶1 000)在4 ℃下恒溫孵育,PBS沖洗3次后,加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的IgG二抗(稀釋比為1 ∶3 000)共同孵育,PBS再次清洗3次,加入二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DBA)染色后用蘇木精復(fù)染,脫水透明后封片。

1.6 觀察指標(biāo)

分別于造模后第1天及第7天對大鼠體質(zhì)量進(jìn)行稱重,記錄大鼠大便性狀及隱血情況,觀察大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)特征。收集大鼠腹主動脈血,高速離心后取上清液,采用放射免疫法[9]測定腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)的水平。使用Cooper評分對大鼠疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)進(jìn)行評估[10],評價標(biāo)準(zhǔn)為:大鼠體質(zhì)量下降0%時記0分,體質(zhì)量下降1%-5%時記1分,體質(zhì)量下降5%-10%時記2分,體質(zhì)量下降10%-15%時記3分,體質(zhì)量下降比高于15%記4分。大便性狀為正常時記0分,性狀呈松散時記1-2分,大便不成型或便稀時記3-4分。隱血記1-2分,血便肉眼可見時記3-4分。DAI總分為體質(zhì)量下降比、大便形狀和隱血得分總和除以3。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清TNF-α、CRP水平變化

造模后第1天各組大鼠血清TNF-α、CRP水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),經(jīng)不同方式營養(yǎng)干預(yù)7 d后,與對照組相比,模型組大鼠TNF-α、CRP水平顯著升高(P<0.05),而與模型組相比,EN組和EIN組的TNF-α和CRP水平顯著下降(P<0.05),且EIN水平更低(P<0.05,見表1)。

表1 各組大鼠血清TNF-α、CRP水平變化

2.2 各組大鼠體質(zhì)量變化

與對照組相比,模型組大鼠體質(zhì)量增長值顯著下降,而與模型組相比,EN組和EIN組大鼠體質(zhì)量增長值明顯增加(P<0.05),且EIN組增長值更高(P<0.05,見表2)。

表2 各組大鼠體質(zhì)量增長值

2.3 各組大鼠DAI評分變化

第1天及第7天對照組大鼠DAI評分均為0分,EN組和EIN組DAI評分均顯著低于模型組,且EIN組的評分更低(P<0.05,見表3)。

表3 各組大鼠DAI評分變化分)

2.4 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)差異

對照組大鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)完整,腺體清晰可見,上皮細(xì)胞排列整齊且呈連續(xù)性,未觀察到炎性細(xì)胞浸潤和潰瘍等炎癥反應(yīng)癥狀;模型組大鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)混亂,腺體模糊,腺腔破壞,上皮細(xì)胞排列雜亂,觀察到明顯的炎癥反應(yīng)癥狀,具體表現(xiàn)為腸絨毛稀疏,部分上皮細(xì)胞脫落,有深淺程度不同的裂隙樣潰瘍,絨毛水腫萎縮壞死,有明顯炎癥細(xì)胞浸潤;EN組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)混亂程度有所減輕,可隱約觀察到腺體結(jié)構(gòu),炎癥反應(yīng)癥狀有所改變;EIN組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)較為完整,腺體結(jié)構(gòu)較為清晰,細(xì)胞排列有序,且連續(xù)性較好,炎癥細(xì)胞浸潤及潰瘍等癥狀基本消失(見圖1,2)。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理變化Figure 1 Pathological changes of colon tissues in rats in each group

與對照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05;與EN組相比,@P<0.05圖2 大鼠結(jié)腸炎癥病理評分Figure 2 Pathological score of colon inflammation in rats after different treatment

2.5 各組大鼠腸黏膜IL-17A水平差異

對照組結(jié)腸黏膜組織中IL-17A陽性染色細(xì)胞數(shù)幾乎沒有,模型組結(jié)腸黏膜組織細(xì)胞質(zhì)中IL-17A陽性染色數(shù)明顯增多。與模型組相比,EN組和EIN組IL-17A陽性細(xì)胞染色數(shù)顯著減少(P<0.05),且EIN組陽性細(xì)胞數(shù)更少(P<0.05,見表4)。

表4 各組大鼠腸黏膜IL-17A陽性細(xì)胞染色數(shù)比較

3 討論

IBD是以克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎為主的特發(fā)性慢性胃腸道疾病,IBD疾病隱患從兒童時期開始,難以治愈,對兒童的生長發(fā)育、心理健康均造成極大負(fù)面影響,約40%的IBD患兒出現(xiàn)生長發(fā)育遲緩及青春期延遲情況[11]。IBD的病因尚不明確,現(xiàn)有的研究推測,原發(fā)性IBD與遺傳因素、免疫失調(diào)及腸道微生物群紊亂有關(guān),而繼發(fā)性IBD則與藥物作用、器官移植以及腸道手術(shù)等因素有關(guān)[12,13]。腸道真菌與微生物共同作用,維持健康人群腸道和機(jī)體平衡,腸黏膜是平衡腸道微生態(tài)的重要屏障,完整的腸黏膜屏障是抵抗腸源性細(xì)菌異位感染的重要方式,腸黏膜受損時機(jī)體炎癥水平快速升高,腸內(nèi)免疫微生態(tài)失衡,紊亂失衡的腸道真菌及微生物進(jìn)一步加重IBD患者的病情[14]。因此,維持腸道微生態(tài)平衡,保護(hù)腸黏膜屏障對于IBD患者的臨床治療意義重大。

有研究指出,皮質(zhì)類固醇等腸內(nèi)營養(yǎng)支持療法治療IBD患兒效果較好,可以有效保護(hù)患兒胃腸道功能,預(yù)防和控制疾病相關(guān)營養(yǎng)不良,緩解患兒腹瀉便血等臨床癥狀,降低發(fā)病率和死亡率[15]。腸內(nèi)免疫微生態(tài)營養(yǎng)支持是基于傳統(tǒng)營養(yǎng)療法進(jìn)行改進(jìn)的新型營養(yǎng)支持方式,在傳統(tǒng)療法基礎(chǔ)上同步給予腸道活菌[16],本次旨在探討腸內(nèi)免疫微生態(tài)營養(yǎng)支持對IBD大鼠腸黏膜屏障的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。本研究結(jié)果顯示,腸內(nèi)免疫微生態(tài)營養(yǎng)支持可顯著降低IBD大鼠血清炎癥因子TNF-α及CRP水平,避免大鼠體質(zhì)量短時快速下降,改善模型大鼠的DAI評分,保護(hù)腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能,改善炎癥細(xì)胞浸潤及潰瘍等炎癥反應(yīng)。原因在于,腸內(nèi)免疫微生態(tài)營養(yǎng)支持在常規(guī)營養(yǎng)支持上添加雙歧桿菌三聯(lián)活菌等益生菌制劑,在腸黏膜表面形成有效的防御屏障,顯著提高腸黏膜的通透性,抵抗病原菌入侵,抑制腸黏膜炎癥改變,加速腸黏膜愈合,消除炎癥反應(yīng)[17]。因此,腸內(nèi)免疫微生態(tài)營養(yǎng)支持對于IBD模型大鼠腸黏膜功能有顯著的保護(hù)作用。

從分子角度分析,IBD的發(fā)病與腸道微生物的串?dāng)_有關(guān),腸道細(xì)菌代謝形成的短鏈脂肪酸影響腸道內(nèi)外的免疫反應(yīng)[18],梭狀芽孢桿菌等黏附在上皮細(xì)胞上的細(xì)胞通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化改變Th17細(xì)胞亞群的水平[19],而Th17細(xì)胞亞群也被證實參與多種自身性免疫疾病和慢性炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制,IL-17A是Th17細(xì)胞釋放的特異性效應(yīng)因子,IL-17A的表達(dá)水平越高,機(jī)體炎癥水平也越高[20]。本次研究指出,腸內(nèi)免疫微生態(tài)營養(yǎng)支持干預(yù)可顯著抑制IL-17A的表達(dá),從而減輕大鼠機(jī)體內(nèi)炎癥水平。推測其原因可能為,添加了活性益生菌的腸內(nèi)免疫微生態(tài)營養(yǎng)干預(yù)方式,因益生菌獨(dú)特的生物活性,可以有效激活免疫反應(yīng),下調(diào)模型大鼠腸黏膜組織中IL-17A的表達(dá)水平,緩解炎癥水平,同時加速腸胃蠕動以及多種生物酶的合成,平衡腸道菌群,加速營養(yǎng)物質(zhì)吸收,幫助增強(qiáng)抵抗力和免疫力[21],最終發(fā)揮保護(hù)腸黏膜屏障的效應(yīng)。

綜上所述,腸內(nèi)免疫微生態(tài)營養(yǎng)支持對炎癥性腸病大鼠腸黏膜功能有較好的保護(hù)作用,通過抑制Th17細(xì)胞特異性標(biāo)記物IL-17A的表達(dá),下調(diào)炎癥因子水平,抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng),維持大鼠體質(zhì)量,改善疾病活動指數(shù)評分,對于炎癥性腸病大鼠的治療效果甚佳,為兒童炎癥性腸病的臨床治療提供了新的方向。