李 燕,李安琪,余曉洋,張文靜,呂 佳,王志剛,張亞莉,陳 蕾

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟病醫(yī)院腎臟內(nèi)科,西安 710061;2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科;3西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液凈化科;*通訊作者,E-mail:chl1221@hotmail.com)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是發(fā)生在糖尿病患者中的腎臟性疾病,也是2型糖尿病患者死亡的主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì),大約有40%的2型糖尿病患者最終發(fā)展為DN,并演變?yōu)榻K末期腎臟病,同時(shí)還增加了心血管類(lèi)疾病的發(fā)生率[1,2]。盡管目前已開(kāi)發(fā)出可控制DN的藥理策略,但仍需全面了解調(diào)節(jié)DN進(jìn)展的相關(guān)機(jī)制,探究更安全有效的方法來(lái)延緩DN進(jìn)程,這也是當(dāng)前DN研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)內(nèi)容。

環(huán)磷酰胺是一種烷化劑,已廣泛應(yīng)用于治療人類(lèi)和動(dòng)物的多種類(lèi)型癌癥,具有抗炎和免疫抑制作用,并且能夠有效殺死進(jìn)入循環(huán)周期的細(xì)胞[3]。此外,環(huán)磷酰胺對(duì)腎病及腎病綜合征具有治療作用,可降低慢性腎小球炎癥患者的BUN、SCr、MMP-2及24 h尿蛋白水平[4],但其在DN中的作用機(jī)制尚不明確。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators-activated receptors-γ,PPAR-γ)是細(xì)胞核激素受體,也屬于核轉(zhuǎn)錄超家族成員之一,在調(diào)節(jié)脂質(zhì)體和葡萄糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,并已有研究發(fā)現(xiàn),PPAR-γ能夠抑制肝臟的纖維化[5,6]。本研究通過(guò)環(huán)磷酰胺作用于DN小鼠,并使用PPAR-γ抑制劑進(jìn)行干預(yù),從而探討環(huán)磷酰胺調(diào)控PPAR-γ改善DN小鼠腎損傷的相關(guān)作用機(jī)制,以期為DN的診治研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)C57小鼠,體質(zhì)量18-23 g,雌雄各半,由醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼喂,飼養(yǎng)溫度設(shè)置為(23±2)℃,12 h光照/黑暗交替循環(huán),期間自由進(jìn)食、飲水。本研究獲得醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):2020-0034)。

1.2 藥品、主要材料與試劑

環(huán)磷酰胺注射液購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司(批號(hào):07051521),PPAR-γ抑制劑GW9662和鏈脲佐菌素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,24 h尿蛋白(24 h UP)、血糖(BG)、甘油三酯(TRIG)、膽固醇(CHOL)、血肌酐(SCr)以及尿素氮(BUN)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所,ROS熒光探針-二氫乙啶(DHE)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博生物科技公司,HE染色試劑盒和Epon812包埋樹(shù)脂試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司,Masson染色試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,兔源抗體Beclin1、p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ與大鼠源抗體PPAR-γ、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,抗體GAPDH和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗鼠購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司,BCA蛋白檢測(cè)試劑盒和增強(qiáng)型ECL發(fā)光液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 動(dòng)物造模

將實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,實(shí)驗(yàn)組小鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng),對(duì)照組小鼠以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng),連續(xù)喂養(yǎng)8周。8周后,所有小鼠禁食不禁水12 h,實(shí)驗(yàn)組小鼠以35 mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素-檸檬酸鈉混合溶液,對(duì)照組小鼠同時(shí)注射等量的檸檬酸鈉溶液。在注射3 d后,通過(guò)尾靜脈采血檢測(cè)小鼠血糖水平,以血糖大于16.7 mmol/L為糖尿病模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)。在注射2周后收集小鼠尿液,檢測(cè)24 h尿蛋白,蛋白含量大于30 mg/24 h即為陽(yáng)性,若3次檢測(cè)均為陽(yáng)性時(shí),則判定為DN小鼠模型構(gòu)建成功。

1.4 動(dòng)物分組與給藥

取造模成功的45只DN小鼠,按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組:模型組、環(huán)磷酰胺組、環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組,每組15只,另取對(duì)照組小鼠15只。環(huán)磷酰胺組小鼠以30 mg/kg的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺(溶解于生理鹽水中),環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組小鼠以30 mg/kg的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺,同時(shí)按1 mg/kg的劑量腹腔注射PPAR-γ的抑制劑GW9662,對(duì)照組和模型組小鼠同時(shí)注射等量生理鹽水,連續(xù)10周。10周后處死各組小鼠前測(cè)量體質(zhì)量,收集24 h尿液,并采集靜脈血,腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉并通過(guò)頸椎脫臼法處死各組小鼠,切取小鼠雙側(cè)腎臟,清洗干凈后稱(chēng)質(zhì)量,將一部分腎組織置于液氮中冷凍后保存于-80 ℃冰箱,剩余部分固定于4%多聚甲醛溶液中。

1.5 全自動(dòng)生化儀檢測(cè)各項(xiàng)生化相關(guān)指標(biāo)

末次給藥結(jié)束后,收集采集的各組小鼠24 h尿液和靜脈血,將采集的血液置于室溫下2 h,通過(guò)4 ℃低溫離心機(jī)以4 000 r/min離心15 min,獲取上清液,進(jìn)行各項(xiàng)血指標(biāo)測(cè)定。應(yīng)用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)各組小鼠24 h尿蛋白(24 h-urinary proteins,24 h UP)、血糖(blood glucose,BG)、甘油三酯(triglyce-ride,TRIG)、膽固醇(cholesterol,CHOL)、血肌酐(serum creatinine,SCr)和尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)的水平,所有檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.6 HE染色觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)

取在4%多聚甲醛固定好的腎組織樣品,進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋處理,切成5 μm的組織切片,進(jìn)行HE染色。將腎組織石蠟切片經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后,加入蘇木精染色5 min,在流水下沖洗干凈,加入伊紅染色3 min,再次通過(guò)流水沖洗干凈,程序化脫水、透明,自然晾干,中性樹(shù)膠封片,通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察各組小鼠腎組織病理形態(tài)變化并拍攝圖像。

1.7 Masson染色檢測(cè)腎組織纖維化程度

取制備好的腎組織石蠟切片,進(jìn)行脫蠟脫水處理,加入weigert鐵蘇木素染色10 min,再用1%鹽酸乙醇分化,流水沖洗干凈后,加入Masson染液進(jìn)行反藍(lán),蒸餾水洗滌干凈,加入麗春紅酸性品紅染色5 min,接著用1%磷鉬酸水進(jìn)行分化后,加入苯胺藍(lán)染色5 min,1%冰醋酸水溶液浸泡洗滌切片,程序化脫水、透明,中性樹(shù)膠封片,通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察各組小鼠腎組織染色情況并拍攝圖像。

1.8 透射電子顯微鏡觀察腎組織自噬體

取小鼠腎組織樣品,切成大小為1.0 mm3的小方塊,并固定在PBS緩沖液稀釋的3%戊二醛中,4 ℃過(guò)夜。接著使用1%鋨酸固定1 h,不同濃度丙酮(50%-90%)進(jìn)行脫水,Epon812包埋。取包埋塊,光鏡下進(jìn)行超薄切片,采用醋酸鈾和枸櫞酸鉛進(jìn)行雙重染色,在Zeiss 910透射電子顯微鏡下觀察腎組織自噬發(fā)生情況并拍攝圖像。

1.9 ROS熒光探針-DHE檢測(cè)腎組織ROS含量

取制備好的腎組織包埋塊,在冰凍切片機(jī)上切成5 μm厚的切片,將ROS熒光探針DHE滴加于切片上,37 ℃下孵育30 min,通過(guò)熒光顯微鏡觀察小鼠腎組織內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度并拍攝圖像。在細(xì)胞內(nèi)DHE被ROS氧化形成氧化乙啶,產(chǎn)生紅色熒光,利用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件量化熒光強(qiáng)度。

1.10 Western blot檢測(cè)腎組織PPAR-γ、自噬及AMPK/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取保存在-80 ℃冰箱中的腎組織,無(wú)菌條件下剪碎后加入液氮進(jìn)行研磨,加入預(yù)冷的RIPA緩沖液進(jìn)行裂解,提取總蛋白樣品,BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取等量各組蛋白樣品,10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì),電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,室溫下在5%脫脂奶粉中封閉2 h,加入稀釋的一抗抗體Beclin1(1 ∶1 000)、p62(1 ∶1 000)、LC3Ⅰ(1 ∶1 000)、LC3Ⅱ(1 ∶1 000)、PPAR-γ(1 ∶1 000)、AMPK(1 ∶1 000)、p-AMPK(1 ∶1 000)、mTOR(1 ∶1 000)、p-mTOR(1 ∶1 000),4 ℃下共孵育過(guò)夜。次日,棄去一抗工作液,TBST洗膜后,加入對(duì)應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗抗體(1 ∶5 000),室溫下共孵育1 h,TBST再次洗膜后,滴加增強(qiáng)型ECL液顯色曝光,凝膠成像系統(tǒng)拍照,通過(guò)Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件對(duì)各蛋白條帶進(jìn)行分析,以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量與腎臟質(zhì)量比較

各組小鼠體質(zhì)量和腎臟質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組小鼠體質(zhì)量和腎臟質(zhì)量均顯著減少(P<0.05);環(huán)磷酰胺組小鼠的體質(zhì)量和腎臟質(zhì)量較模型組均顯著增加(P<0.05),而與環(huán)磷酰胺組比較,環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組小鼠的體質(zhì)量和腎臟質(zhì)量均顯著減少(P<0.05,見(jiàn)圖1)。

與對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與環(huán)磷酰胺組比較,&P<0.05圖1 各組小鼠體質(zhì)量與腎臟質(zhì)量比較Figure 1 Comparison of body mass and kidney mass of mice in each group

2.2 各組小鼠24 h UP和血生化指標(biāo)比較

各生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組小鼠24 h UP水平顯著升高(P<0.05),血清BG、TRIG、CHOL、SCr和BUN水平也顯著升高(P<0.05);而治療10周后,相較于模型組,環(huán)磷酰胺組小鼠24 h UP水平顯著降低(P<0.05),同時(shí),血清BG、TRIG、CHOL、SCr和BUN水平顯著降低(P<0.05);而環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組小鼠24 h UP水平與血清BG、TRIG、CHOL、SCr及BUN水平較環(huán)磷酰胺組均顯著升高(P<0.05,見(jiàn)表1)。

表1 各組小鼠24 h UP與血生化指標(biāo)的水平比較

2.3 各組小鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察

HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠腎組織中腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常,未見(jiàn)明顯病變現(xiàn)象;模型組小鼠腎組織內(nèi)腎小管萎縮、壞死,出現(xiàn)空泡樣,腎小球基底膜增厚,系膜區(qū)增多,并伴隨大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn);環(huán)磷酰胺組小鼠腎小管萎縮、壞死以及腎小球基底膜增厚等現(xiàn)象較模型組明顯減輕,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少;而環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組小鼠腎組織病變現(xiàn)象與模型組較一致,未見(jiàn)明顯改善(見(jiàn)圖2)。

圖2 HE染色觀察小鼠腎組織病理形態(tài)學(xué) (×400)Figure 2 Pathological morphology of mouse kidney tissue by HE staining (×400)

2.4 各組小鼠腎組織纖維化程度比較

Masson染色結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠腎組織內(nèi)藍(lán)染面積少,膠原沉積少,說(shuō)明腎組織纖維化程度小;與對(duì)照組比較,模型組小鼠腎組織內(nèi)藍(lán)染面積增多,膠原沉積增加,纖維束增粗,腎組織纖維化明顯;相較于模型組,環(huán)磷酰胺組小鼠組織內(nèi)藍(lán)染面積減少,膠原沉積有所下降,腎組織纖維化程度減小;而與環(huán)磷酰胺組比較,環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組小鼠腎組織藍(lán)染面積增多,腎組織纖維化現(xiàn)象較為明顯(見(jiàn)圖3)。

箭頭顯示腎組織內(nèi)明顯的藍(lán)染區(qū)域圖3 Masson染色觀察小鼠腎組織纖維化程度 (×400)Figure 3 Observation of the degree of fibrosis in mouse kidney tissue by Masson staining (×400)

2.5 各組小鼠腎組織足細(xì)胞自噬情況

通過(guò)透射電子顯微鏡觀察到,對(duì)照組小鼠腎組織足細(xì)胞可見(jiàn)較多的自噬體與凋亡小體,說(shuō)明正常情況下腎組織足細(xì)胞自噬程度較高;模型組小鼠足細(xì)胞自噬體與凋亡小體較對(duì)照組則明顯減少;而環(huán)磷酰胺組小鼠足細(xì)胞自噬體與凋亡小體較模型組明顯增多,說(shuō)明環(huán)磷酰胺能夠促進(jìn)足細(xì)胞自噬;環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組小鼠可見(jiàn)少量自噬體,與模型組比較無(wú)明顯變化(見(jiàn)圖4)。

黃色三角箭頭所指為自噬體圖4 透射電子顯微鏡觀察腎組織自噬 (×10 000)Figure 4 Observation of autophagy in kidney tissue under transmission electron microscope (×10 000)

2.6 各組小鼠腎組織ROS含量比較

DHE熒光染色檢測(cè)結(jié)果顯示,模型組小鼠腎組織經(jīng)DHE熒光染色后,其ROS熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組(P<0.05);與模型組比較,環(huán)磷酰胺組小鼠腎組織ROS熒光強(qiáng)度則顯著下降(P<0.05);而相較于環(huán)磷酰胺組,環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組小鼠腎組織ROS熒光強(qiáng)度顯著升高(P<0.05,見(jiàn)圖5)。

圖5 DHE熒光染色檢測(cè)小鼠ROS生成 (×400)Figure 5 ROS level in mice by DHE fluorescent staining (×400)

2.7 各組小鼠腎組織PPAR-γ蛋白、自噬相關(guān)蛋白與AMPK/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組小鼠腎組織PPAR-γ、Beclin-1蛋白表達(dá)與LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均顯著下調(diào),P62蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05);與模型組比較,環(huán)磷酰胺組小鼠腎組織PPAR-γ、Beclin-1蛋白表達(dá)與LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均顯著上調(diào),P62蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05);而相較于環(huán)磷酰胺組,環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組小鼠腎組織PPAR-γ、Beclin-1蛋白表達(dá)與LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值則顯著下調(diào),同時(shí),P62蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05,見(jiàn)圖6)。

與對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與環(huán)磷酰胺組比較,&P<0.05圖6 Western blot檢測(cè)小鼠腎組織PPAR-γ蛋白與自噬相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 6 Expression of PPAR-γ protein and autophagy-related protein in mouse kidney tissue by Western blot

通過(guò)檢測(cè)AMPK/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),模型組小鼠腎組織p-AMPK/AMPK比值較對(duì)照組顯著下降,p-mTOR/mTOR比值則顯著升高(P<0.05);與模型組比較,環(huán)磷酰胺組腎組織p-AMPK/AMPK比值顯著升高,p-mTOR/mTOR比值則顯著下降(P<0.05);相較于環(huán)磷酰胺組,環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組腎組織p-AMPK/AMPK比值較對(duì)照組顯著下降,而p-mTOR/mTOR比值顯著升高(P<0.05,見(jiàn)圖7)。

與對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與環(huán)磷酰胺組比較,&P<0.05圖7 Western blot檢測(cè)小鼠腎組織AMPK/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 7 Expression of AMPK/mTOR signaling pathway related protein expression in mouse kidney tissue by Western blot

3 討論

DN是1型和2型糖尿病患者腎小球和腎小管病變引起的一種頻繁且復(fù)雜的長(zhǎng)期性微血管并發(fā)癥。DN的主要病理特征是腎小球?yàn)V過(guò)率降低,腎小球硬化,腎小管間質(zhì)纖維化和腎小管上皮細(xì)胞損傷[2]。由于DN具有隱匿性發(fā)作的特點(diǎn),因此很難在疾病早期進(jìn)行檢測(cè)和診斷。然而,腎臟病變是不可逆的,當(dāng)出現(xiàn)某些癥狀時(shí)最終發(fā)展為腎功能衰竭的幾率很大[7]。因此,探究DN的早期檢測(cè)手段和靶向治療方法對(duì)于治療或緩解DN腎損傷具有重要意義。本研究通過(guò)模擬2型糖尿病腎病的自然病程建模,探究環(huán)磷酰胺減輕DN小鼠腎損傷的作用,進(jìn)一步明確環(huán)磷酰胺在DN中相關(guān)調(diào)控機(jī)制,為研究DN提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

環(huán)磷酰胺作為一種抑制細(xì)胞增殖的烷化劑,常用于治療不同類(lèi)型的癌癥、器官移植和自身免疫性疾病[8]。環(huán)磷酰胺會(huì)觸發(fā)次級(jí)淋巴器官的特定腸道菌群,并通過(guò)刺激抗腫瘤細(xì)胞因子例如干擾素-γ(IFN-γ)和白細(xì)胞介素-17(IL-17)的產(chǎn)生來(lái)激活抗腫瘤免疫力[9],例如Wong等[10]報(bào)道指出,連續(xù)口服環(huán)磷酰胺對(duì)卵巢癌、原發(fā)性腹膜癌和輸卵管癌的化療患者均起到了一定的緩解作用,且未發(fā)現(xiàn)明顯的副作用。環(huán)磷酰胺在增殖性腎臟病中應(yīng)用廣泛,且近年來(lái)在糖尿病腎病中的作用機(jī)制也逐漸被揭示,前期我們的研究[11]表明了環(huán)磷酰胺能夠抑制DN大鼠腎組織中單核細(xì)胞趨化因子蛋白-1(MCP-1)與生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)表達(dá),從而緩解DN大鼠腎損傷。PPAR-γ可促進(jìn)脂肪生成,并調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)和脂肪細(xì)胞因子(如瘦素和脂聯(lián)素)的表達(dá),以此來(lái)控制脂質(zhì)代謝和脂肪細(xì)胞分化,從而降低脂毒性。研究表明,激活PPARγ可通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和改善胰島素敏感性來(lái)治療糖尿病,并具有治療DN的潛在作用[12,13]。本研究結(jié)果顯示,DN小鼠通過(guò)環(huán)磷酰胺治療后,腎損傷現(xiàn)象得到了明顯改善,同時(shí)檢測(cè)到腎組織內(nèi)PPAR-γ表達(dá)提高,而經(jīng)過(guò)環(huán)磷酰胺和PPAR-γ抑制劑共同作用的DN小鼠的腎組織損傷未發(fā)生改變,由此推測(cè),環(huán)磷酰胺可能通過(guò)激活PPAR-γ發(fā)揮對(duì)DN小鼠腎組織的保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激是DN的重要病理機(jī)制,高血糖是在氧化應(yīng)激中促進(jìn)多余活性氧(ROS)生成的主要危險(xiǎn)因素。ROS具有不成對(duì)電子或原子的氧衍生分子,包括超氧陰離子、過(guò)氧化氫、單線態(tài)氧和一氧化氮自由基等,參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、衰老及多種生理病理過(guò)程。而過(guò)量的ROS會(huì)產(chǎn)生毒性作用,導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化和MDA形成,破壞機(jī)體的氧化平衡狀態(tài)[14]。ROS刺激DN中包括纖連蛋白和Ⅳ型膠原細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的積累,這將會(huì)導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化[15]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)環(huán)磷酰胺治療DN小鼠后,其腎組織內(nèi)ROS水平異常升高的現(xiàn)象受到了明顯抑制。腎浸潤(rùn)或內(nèi)源性細(xì)胞異常會(huì)產(chǎn)生過(guò)量ROS,并與生物分子發(fā)生反應(yīng),從而引發(fā)腎損傷和腎功能障礙。因此,清除組織內(nèi)多余的ROS是DN治療的有效方法。

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)自我修復(fù)機(jī)制,能夠消除降解變性的蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器,維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。足細(xì)胞具有較高的自噬基礎(chǔ)水平,這對(duì)于其應(yīng)激適應(yīng)具有至關(guān)重要的作用[16]。糖尿病患者體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)和能量過(guò)量會(huì)抑制自噬,并使足細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙和細(xì)胞凋亡,進(jìn)而引起一系列生理病理變化[17]。本研究通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),DN小鼠腎組織Beclin-1蛋白表達(dá)、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明顯下降,P62蛋白表達(dá)則明顯上升,說(shuō)明自噬通量受損,而經(jīng)過(guò)環(huán)磷酰胺治療的DN小鼠腎組織自噬水平得以提高,表現(xiàn)為腎組織Beclin-1蛋白表達(dá)與LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上升,P62蛋白表達(dá)下降。

AMP激活的蛋白激酶(AMPK)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。多項(xiàng)研究表明,AMPK/mTOR信號(hào)通路與細(xì)胞自噬相關(guān)。細(xì)胞接受外界刺激時(shí),AMP/ATP水平升高并激活A(yù)MPK,并增強(qiáng)了對(duì)其下游蛋白mTOR的抑制作用,而mTOR是介導(dǎo)自噬發(fā)生的關(guān)鍵蛋白,可調(diào)節(jié)相關(guān)途徑進(jìn)而抑制細(xì)胞自噬[18]。本研究結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)環(huán)磷酰胺治療的DN小鼠腎組織內(nèi)p-AMPK/AMPK比值升高,而p-mTOR/mTOR比值下降,說(shuō)明環(huán)磷酰胺通過(guò)調(diào)控AMPK/mTOR信號(hào)通路影響自噬從而發(fā)揮作用。

綜上,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了環(huán)磷酰胺通過(guò)激活PPAR-γ促進(jìn)DN小鼠腎組織足細(xì)胞發(fā)生自噬,清除過(guò)量的ROS,改善腎損傷現(xiàn)象,該作用機(jī)制可能與AMPK/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。然而,長(zhǎng)期或過(guò)量使用環(huán)磷酰胺也會(huì)增加癌變的風(fēng)險(xiǎn)尤其在膀胱癌,因此,如何更好地將環(huán)磷酰胺運(yùn)用于DN臨床治療中,還需要大規(guī)模較全面的研究證實(shí)。