齊 婷,王述進(jìn),牛 瑜,劉宋芳,馬 磊,楊 華,馮 佳

(西安市第九醫(yī)院內(nèi)分泌科,西安 710054;*通訊作者,E-mail:66248765@qq.com)

肥胖是一種全球性流行病,全球超過6.5億人受到影響;營養(yǎng)過剩是導(dǎo)致2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)的主要誘因[1]。研究表明,非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)在普通人群中的患病率為2%-44%,在T2DM患者中的患病率為42.6%-69.5%[2]。T2DM是一種代謝疾病,其特征為高血糖癥和胰島素抵抗,與血脂代謝紊亂相關(guān)[3]。胰島素抵抗是肥胖、T2DM和NAFLD的常見發(fā)病機(jī)制,尤其與脂肪代謝紊亂有關(guān)[4]。胰島素抵抗通過增加胰腺β細(xì)胞的胰島素分泌來補(bǔ)償;但是,由于最終補(bǔ)償失敗,而導(dǎo)致T2DM的發(fā)展[5]。T2DM中β細(xì)胞質(zhì)量和功能的喪失很大程度上導(dǎo)致血糖控制的逐步惡化和對T2DM中胰島素治療的依賴性增加[6]。

同時,脂質(zhì)對于作為能量來源的β細(xì)胞,以及生物膜的構(gòu)建單元和信號分子是必不可少的。脂肪酸在β細(xì)胞中具有獨特的功能性作用,因為它們會急劇增加葡萄糖刺激的胰島素分泌[7]。Roux-en-Y胃旁路手術(shù)(Roux-en-Y gastric bypass,RYGB)能有效治療肥胖T2DM患者的脂代謝紊亂,降低肝臟脂質(zhì)毒性,改善肝臟胰島素抵抗,延緩甚至逆轉(zhuǎn)NAFLD[8,9]。然而,RYGB減少肝臟脂肪堆積的機(jī)制尚不清楚。

研究表明,RYGB手術(shù)4周后,肝臟自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平升高,選擇性自噬連接蛋白P62降低,自噬活性增強(qiáng),肝內(nèi)脂肪堆積減少,這提示RYGB可能通過上調(diào)自噬活性來減輕肝臟脂質(zhì)毒性[10]。本研究進(jìn)一步觀察了在經(jīng)過RYGB手術(shù)2,4,8周后,肥胖T2DM大鼠肝臟胰島素敏感性及脂肪合成、分泌和分解代謝途徑的變化,重點探討了RYGB降低肝臟脂質(zhì)毒性、改善肝臟胰島素抵抗和抑制NAFLD的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

鏈脲佐菌素(S0130,Sigma-Aldrich,美國);檸檬酸(251275,Sigma-Aldrich,美國);戊巴比妥鈉(P0500000,北京邁瑞達(dá)科技有限公司);美洛昔康(1379401,西寶生物科技(上海)股份有限公司);甘油三酯(TG)含量檢測試劑盒(BC0625,北京索萊寶科技有限公司);PierceTMBCA蛋白分析試劑盒(A53225,Thermo ScientificTM,美國);胎牛血清(16140071,GibcoTM,美國);DMEM(12491015,GibcoTM,美國);氯喹(C843545,上海麥克林生化科技有限公司);MHY1485(HY-B0795,MedChemExpress,美國);exendin-4(HY-13443,MedChemExpress,美國)。DGAT2(PA5-26690,Invitrogen,美國);p-HSL(4137,Cell Signaling,美國);ATGL(2138,Cell Signaling,美國);MTP(ab75316,Abcam,英國);LC3Ⅰ/Ⅱ(4108,Cell Signaling,美國);p62(3912,Cell Signaling,美國);mTOR(2972,Cell Signaling,美國);p-mTOR(2971,Cell Signaling,美國);雙能X線骨密度儀(蘇械注準(zhǔn)20182061513,徐州品源電子科技有限公司)。

1.2 實驗動物及分組

4周齡雄性SD大鼠40只購自西安交通大學(xué)動物實驗中心(SCXK(陜)2020-001),體質(zhì)量為180-200 g。所有動物實驗均取得本院倫理委員會的批準(zhǔn)(編號:No.2019-11023),且動物實驗人員均經(jīng)過培訓(xùn)并經(jīng)倫理委員會的認(rèn)可后進(jìn)行操作。所有動物都飼養(yǎng)于單獨的籠子,其生活環(huán)境:溫度(24±2)℃,每天12 h的光/暗,標(biāo)準(zhǔn)的顆粒飼料喂養(yǎng),飲用水充足,實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究共分為:正常對照組(n=10,control組)、糖尿病模型組(n=10,DM組)、糖尿病假手術(shù)組(n=10,DM+sham組)和RYGB手術(shù)組(n=10,RYGB組)。糖尿病模型組、糖尿病假手術(shù)組和RYGB組大鼠均接受高脂肪飲食(40%脂肪、18%蛋白質(zhì)和42%碳水化合物),飼養(yǎng)6周。糖尿病模型組、糖尿病假手術(shù)組和RYGB組大鼠于6周末進(jìn)行尾靜脈注射小劑量鏈脲佐菌素(25 mg/kg),大鼠空腹血糖的濃度大于16.7 mmol/L并持續(xù)4周表示糖尿病大鼠模型造模成功(造模成功率為90%,死亡率為5%),當(dāng)血糖明顯升高(超過33.3 mmol/L),則暫停1次注射。這三組大鼠的血糖水平通過血糖儀進(jìn)行每周1次的檢測,其降糖治療方法采用暫停補(bǔ)糖或注射胰島素(中性魚精蛋白鋅胰島素,每次2-3 U,持續(xù)3 d)。正常對照組大鼠則接受標(biāo)準(zhǔn)飲食(18%脂肪、25%蛋白質(zhì)和57%碳水化合物),并采用相同劑量的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液做對照處理。

1.3 手術(shù)動物模型構(gòu)建

糖尿病假手術(shù)組和RYGB組大鼠在術(shù)前禁食24 h,然后腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液(4.5 ml/kg)麻醉。RYGB組大鼠采用2-0絲線雙重結(jié)扎遠(yuǎn)端胃,形成約20%的胃袋;橫斷小腸形成15 cm的膽胰肢、10 cm的消化肢和33 cm的共同通道。胃空腸和空腸吻合術(shù)采用5-0絲線間斷縫合,肌層和皮膚用4-0絲線縫合。糖尿病假手術(shù)組大鼠術(shù)前和術(shù)后接受與RYGB組大鼠相似的護(hù)理,胃腸道切口采用與RYGB大鼠模型相同處理,切口在原橫斷點重新吻合。手術(shù)后,糖尿病假手術(shù)組和RYGB組大鼠均皮下注射約25 ml/kg的生理鹽水以防止脫水,然后每隔8 h皮下注射美洛昔康1 mg/kg,持續(xù)24 h。術(shù)后0-8周定期每周測量大鼠體質(zhì)量、攝食率和血糖。術(shù)后8周采取斷頭法處死各組大鼠,收集肝組織,保存于-80 ℃做下一步分析。

1.4 肝臟胰島素敏感性指數(shù)測定

禁食后,麻醉大鼠,放置導(dǎo)管,植入右側(cè)頸內(nèi)靜脈輸液,左側(cè)頸動脈采血。大鼠禁食12 h后,經(jīng)頸靜脈導(dǎo)管注入胰島素和20%葡萄糖。每隔5 min測量一次動脈血糖,并調(diào)整葡萄糖輸注速率以維持血糖濃度的穩(wěn)定。[6-3H]葡萄糖(20 μCi/min推注+0.4 μCi/min輸注)用于評估內(nèi)源性葡萄糖的產(chǎn)生。以肝臟胰島素敏感性指數(shù)(hepatic insulin sensitivity index, HISI)表示肝臟胰島素敏感性,HISI=1/(肝臟葡萄糖產(chǎn)量×空腹胰島素)。術(shù)后0-8周定期每周采集各組大鼠血液以計算肝臟胰島素敏感性指數(shù)。

1.5 大鼠全身成分測定及肝組織脂質(zhì)含量測定

采用雙能X線骨密度儀對大鼠進(jìn)行測量[11],所有大鼠在掃描前禁食和鎮(zhèn)靜。掃描結(jié)束后,并通過以下公式評估每個大鼠體脂含量和去脂體質(zhì)量情況(脂肪質(zhì)量=體質(zhì)量×體脂率,去脂體質(zhì)量=體質(zhì)量-脂肪質(zhì)量)。術(shù)后0-8周定期每周測定各組大鼠的體脂含量和去脂體質(zhì)量指標(biāo),分別在術(shù)后2周、4周和8周斷頭法處死各組大鼠3只并分離和收集大鼠肝組織。取肝組織標(biāo)本在3%甲醛中固定過夜,用去離子水沖洗3次(每次30 s)去除多余甲醛,然后將標(biāo)本包埋于Tablet-Tek最佳切割復(fù)合物中,切片為7 μm,并進(jìn)行油紅O脂質(zhì)染色,用Image J軟件對肝細(xì)胞大小和油紅O染色面積進(jìn)行定量。使用甘油三酯(TG)含量檢測試劑盒測量肝臟甘油三酯水平。在冰浴條件下,用10倍體積的無水乙醇機(jī)械勻漿,從冰凍的基礎(chǔ)組織中提取肝組織;去除有機(jī)相和水相,樣品在2 500 r/min下離心15 min,取小等分(10-30 μl)測定甘油三酯濃度。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測DGAT2、p-HSL、ATGL、MTP、LC3Ⅰ/Ⅱ、p62和mTOR蛋白表達(dá)水平

分別在術(shù)后2周、4周和8周分離和收集各組大鼠肝組織,并對分離的各組大鼠肝組織進(jìn)行充分的液氮研磨破碎,通過RAPI裂解液對分離的大鼠肝組織進(jìn)行裂解,然后通過BSA蛋白檢測試劑盒對蛋白進(jìn)行定量分析。使用10%蛋白分離膠進(jìn)行SDS-PAGE(蛋白上樣量為30 μg),待電泳結(jié)束后,轉(zhuǎn)移至PVDF膜。隨后,將膜與一抗DGAT2(1 ∶1 000)、p-HSL(1 ∶1 000)、ATGL(1 ∶1 000)、MTP(1 ∶1 000)、LC3I/II(1 ∶1 000)、P62(1 ∶1 000)、mTOR(1 ∶1 000)和p-mTOR(1 ∶1 000)于4 ℃過夜孵育。然后,使用TBST清洗膜3次,每次5 min;然后將膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗IgG(1 ∶2 000)在室溫下孵育1 h;使用TBST清洗膜3次,每次5 min后,通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)并使用GE Image Quant 25 LAS4000 mini進(jìn)行可視化蛋白帶分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計分析采用SPSS 20.0,定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間差異比較采用t檢驗分析,多組間差異比較采用單因素方差分析,兩兩比較差異采用LSD檢驗分析,P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RYGB明顯改善大鼠身體機(jī)能各項指標(biāo)

RYGB組大鼠空腹血糖水平在術(shù)后3周內(nèi)持續(xù)下降,3周時接近control組,隨后趨于穩(wěn)定;DM+sham組大鼠無明顯變化(見圖1)。RYGB組大鼠體質(zhì)量在術(shù)后3周內(nèi)持續(xù)下降至最低點,隨后趨于維持穩(wěn)定狀態(tài)(見圖1)。RYGB組大鼠攝食率在術(shù)后1周內(nèi)持續(xù)下降,隨后升高逐漸趨于平穩(wěn)(見圖1)。與DM組和DM+sham組大鼠相比,RYGB組大鼠體脂含量在術(shù)后明顯降低(P<0.05,見圖1),去脂體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖1);與control組大鼠相比,RYGB組大鼠體脂含量和去脂體質(zhì)量在術(shù)后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

與DM組相比,*P<0.05;與DM+sham組相比,#P<0.05圖1 RYGB手術(shù)對大鼠身體機(jī)能指標(biāo)的影響Figure 1 Effect of RYGB operation on the body function indexes of rats

2.2 RYGB明顯增加肝臟胰島素敏感性

油紅O染色結(jié)果顯示,術(shù)后2周,與DM+sham組相比,RYGB組大鼠的肝臟脂肪質(zhì)量顯著下降,中性脂質(zhì)染色陽性百分率明顯降低,脂滴大小和數(shù)量明顯減少(P<0.05,見圖2)。與DM組相比,DM+sham組大鼠肝臟甘油三酯含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與DM+sham組相比,RYGB組大鼠肝臟甘油三酯含量顯著降低(P<0.05);與DM+sham組比較,RYGB組大鼠肝臟胰島素敏感性指數(shù)明顯升高(P<0.05,見圖2)。

與DM組相比,*P<0.05;與DM+sham組相比,#P<0.05圖2 RYGB手術(shù)對大鼠肝臟胰島素敏感性的影響Figure 2 Effect of RYGB operation on insulin sensitivity of rat liver

2.3 RYGB短時間促進(jìn)水解酶活性并改善肝臟脂質(zhì)蓄積

肝脂質(zhì)代謝途徑中關(guān)鍵酶表達(dá)水平Western blot檢測結(jié)果顯示,術(shù)后2周,與DM+sham組相比,RYGB組大鼠DGAT2和ATGL的表達(dá)水平均明顯降低,而p-HSL和MTP的表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05,見圖3A)。但在術(shù)后4周和術(shù)后8周,DGAT2、ATGL、p-HSL和MTP蛋白的表達(dá)水平在各組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖3B和3C)。

與DM組相比,*P<0.05;與DM+sham組相比,#P<0.05圖3 RYGB手術(shù)對肝脂代謝途徑關(guān)鍵酶DGAT2、ATGL、p-HSL和MTP表達(dá)水平的影響Figure 3 Effect of RYGB operation on expression levels of key enzymes DGAT2, ATGL, p-HSL and MTP in the liver lipid metabolism pathway

2.4 RYGB促進(jìn)肝臟自噬

Western blot實驗結(jié)果顯示,術(shù)后2周,與DM+sham組比較,RYGB組大鼠自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著降低,P62蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);術(shù)后4周,與DM+sham組比較,RYGB組大鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高,P62蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);術(shù)后8周,各組間自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖4)。

與DM組相比,*P<0.05;與DM+sham組相比,#P<0.05圖4 RYGB手術(shù)對大鼠肝臟自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、LC3Ⅰ和P62表達(dá)水平的影響Figure 4 Effect of RYGB operation on expression levels of autophagy-related proteins LC3Ⅱ,LC3Ⅰand P62 in rat liver

2.5 RYGB抑制mTOR/p70S6K信號通路

Western blot檢測mTOR和p70S6K的磷酸化結(jié)果顯示,術(shù)后2周,與DM+sham組比較,RYGB組大鼠肝組織中磷酸化蛋白p-mTOR和p-p70S6K的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05);術(shù)后4周,與DM+sham組比較,RYGB組大鼠肝組織中磷酸化蛋白p-mTOR和p-p70S6K的表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05);術(shù)后8周,各組大鼠肝組織中mTOR和p70S6K蛋白表達(dá)水平及其磷酸化水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖5)。

與DM組相比,*P<0.05;與DM+sham組相比,#P<0.05圖5 RYGB手術(shù)對mTOR和p70S6K蛋白磷酸化的影響Figure 5 Effect of RYGB operation on mTOR and p70S6K protein phosphorylation

3 討論

RYGB已被報道在改善肝臟脂肪變性、炎性壞死和纖維化方面具有效果[12]。據(jù)報道,RYGB術(shù)后1年和5年,肝臟變性、炎癥和纖維化明顯改善,術(shù)后1年和5年肝組織學(xué)無明顯差異[13]。本研究結(jié)果表明,RYGB治療2周后,肥胖T2DM大鼠肝臟DGAT2和ATGL表達(dá)水平明顯降低,而p-HSL和MTP表達(dá)水平明顯增加。術(shù)后2周和4周,自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和P62蛋白表達(dá)水平均顯著降低。這表明,RYGB在短時間內(nèi)抑制脂肪合成并促進(jìn)脂肪水解;同時,RYGB在這段時間內(nèi)迅速降低肝臟TG含量并減輕肝臟胰島素抵抗,通過激活自噬糾正肝脂代謝紊亂。

胰島素抵抗通常被認(rèn)為是NAFLD的起始因素[14],RYGB能顯著改善肝臟胰島素敏感性[15]。本研究結(jié)果表明,術(shù)后2周和4周,RYGB組大鼠肝臟胰島素敏感指數(shù)明顯高于DM+sham組。研究發(fā)現(xiàn),術(shù)后肝臟脂肪變性明顯改善,IR緩解程度與肝臟組織學(xué)改善密切相關(guān)[16]。本研究的油紅O染色結(jié)果顯示,RYGB治療后大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴體積減少,數(shù)量減少。術(shù)后2周和8周后,RYGB組大鼠肝臟甘油三酯(TG)含量分別比DM+sham組顯著下降。這證明RYGB術(shù)后肝臟脂肪的短期下降在術(shù)后肝脂代謝紊亂的恢復(fù)中起關(guān)鍵作用。

微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白(microsomal triglyceride transfer protein,MTP)主要分布于肝細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞中,涉及VLDL組裝和肝臟中TG分泌的關(guān)鍵脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[16]。本研究結(jié)果表明,與DM+sham組相比,RYGB組術(shù)后2周大鼠肝臟DGAT2表達(dá)水平明顯降低,而p-HSL和MTP蛋白表達(dá)水平明顯增加。RYGB短期內(nèi)抑制肝臟TG合成,刺激肝臟TG水解,但對肝臟TG分泌無影響。術(shù)后4周和8周時,DGAT2、P-HSL、ATGL和MTP在糖尿病模型組之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。故推測RYGB手術(shù)通過抑制肝臟局部脂肪合成和上調(diào)肝臟局部脂肪動員來迅速減少脂肪在肝臟中的積聚。

自噬是細(xì)胞依賴溶酶體降解受損細(xì)胞器和大分子的過程[17]。自噬是由溶酶體等細(xì)胞器介導(dǎo),涉及30多種相關(guān)蛋白;其中LC3被認(rèn)為是自噬的標(biāo)志物,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高代表自噬的激活[18]。p62可將泛素化修飾的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到自噬小體,并且p62的聚集隨著自噬被抑制而增加[19]。本研究結(jié)果表明,術(shù)后2周和4周,RYGB組大鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯高于DM+sham組和DM組,而P62蛋白表達(dá)水平明顯降低,這提示RYGB可能激活肝臟自噬功能;RYGB術(shù)后肝臟自噬的激活可能在短期內(nèi)迅速降低肝脂,在長期減少肝脂蓄積中起重要作用。

近年來,RYGB對神經(jīng)系統(tǒng)的影響已成為研究熱點[20]。中樞神經(jīng)系統(tǒng),特別是下丘腦,通過神經(jīng)肽和神經(jīng)遞質(zhì)控制中樞并影響外周能量的動態(tài)平衡[21]。一些研究證實,在RYGB術(shù)后,可明顯觀察到組織器官及系統(tǒng)的變化[22]。肝臟脂肪代謝不僅受體液調(diào)節(jié),還受神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn),RYGB通過激活肝脂水解途徑和抑制肝脂合成途徑,從而迅速降低肝脂毒性并改善胰島素敏感性[23]。據(jù)報道,楊梅和其他植物物種中存在的天然類黃酮異槲皮苷(ISO)對腫瘤細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用,ISO通過激活A(yù)MPK/mTOR/p70S6K途徑抑制細(xì)胞活力和集落生長,激活凋亡途徑,并觸發(fā)自噬失調(diào)。RYGB對肝組織神經(jīng)遞質(zhì)的影響以及術(shù)后神經(jīng)系統(tǒng)對肝脂代謝的影響的研究報道較少。本研究結(jié)果表明,術(shù)后2周和4周,與DM+sham組比較,RYGB組大鼠肝組織中磷酸化蛋白p-mTOR和p-p70S6K的表達(dá)水平均顯著降低。這些結(jié)果表明,RYGB激活了自噬,促進(jìn)了脂質(zhì)代謝,這可能與抑制mTOR/p70S6K信號通路有關(guān)。