韓新源,酉鵬華,雍志軍,張雪婷,王暄齊,楊俊生,王順達*

(1陜西省人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,西安 710068;2陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:Wanda0916@163.com)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一種嚴重的進行性臨床綜合征,以肺血管阻力增加、肺動脈壓力升高為特征,常導(dǎo)致右心衰竭,最終導(dǎo)致死亡[1]。肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展的病理機制包括持續(xù)的肺血管收縮、血管重構(gòu)和原位血栓形成[2,3]。其中血管重構(gòu)在發(fā)病中尤為重要,多由內(nèi)膜增厚和中膜增生引起,肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)增殖/凋亡失衡在這一過程中起著重要作用[4,5]。因此,探索PASMCs增殖/凋亡失衡的分子機制,對預(yù)防或逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu),從而治療肺動脈高壓具有重要意義。有研究表明,5-羥色胺(5-hydroxytrypta,5-HT)參與PAH的發(fā)病機制[6]。PAH患者血漿5-HT濃度升高,而誘導(dǎo)血小板5-HT釋放或抑制5-HT攝取的藥物可能有助于PAH的發(fā)生[7,8]。過氧化物酶增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)屬于核激素受體超家族成員。有證據(jù)表明,PPARγ對PAH發(fā)病機制所涉及的多種途徑有影響,激活PPARγ可以減輕肺血管功能障礙和PAH,而PPARγ的靶向基因缺失與自發(fā)性PAH的發(fā)生有關(guān)[9]。近年來,有研究報道PPARγ也在調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用[10]。但目前尚未有研究評價PPARγ對5-HT誘導(dǎo)的PASMCs增殖和凋亡的影響。故本研究旨在探討5-HT對PASMCs增殖和凋亡及PPARγ表達的影響,特別是PPARγ在5-HT誘導(dǎo)的細胞增殖和凋亡的調(diào)控中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗主要試劑

人PASMCs(美國ATCC公司)、DMEM培養(yǎng)基、標(biāo)準胎牛血清(美國Gibco BRL);MTT(美國Sigma公司)、5-HT(美國Tocris公司)、PD98059(美國Sigma公司);15d-PGJ2、羅格列酮和GW9662(美國Cayman公司);anti-PPARγ抗體(美國Santa Cruz公司);Annexin Ⅴ-FLUOS凋亡檢測試劑盒(美國Roche Diagnostics公司)。

1.2 人PASMCs的培養(yǎng)及分組處理

人PASMCs使用DMEM高糖培養(yǎng)基、10%胎牛血清在設(shè)定溫度為37℃、CO2濃度為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。取第3-7代細胞用于實驗。根據(jù)不同的干預(yù)措施將PASMCs分組,無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,分別給予不同處理:①不同濃度的5-HT(0,10-9,10-8,10-7,10-6,10-5mol/L)培養(yǎng)24 h;②5-HT(10-6mol/L)干預(yù)不同的時間(0,6,12,24,36 h);③PPARγ激動劑、阻斷劑干預(yù):對照組、5-HT(1 μmol/L)、5-HT(1 μmol/L)+15d-PGJ2(10 μmol/L)、5-HT(1 μmol/L)+羅格列酮(10 μmol/L)、5-HT(1 μmol/L)+15d-PGJ2(10 μmol/L)+GW9662(50 μmol/L)、5-HT(1 μmol/L)+羅格列酮(10 μmol/L)+GW9662(50 μmol/L)。

1.3 細胞計數(shù)

通過計數(shù)細胞數(shù)測定PASMCs增殖。將細胞以1×105細胞/孔的濃度接種于6孔板中,在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,然后在無血清培養(yǎng)基中饑餓24 h,用不同濃度的5-HT孵育24 h后,用血細胞計數(shù)儀計數(shù)細胞數(shù)量。實驗重復(fù)3次。

1.4 MTT法檢測PASMCs增殖

將PASMCs在96孔板中培養(yǎng),待細胞單層鋪滿孔底;細胞于無血清的DMEM培養(yǎng)液中孵育24 h,每組設(shè)立5個復(fù)孔;細胞干預(yù)完成后,去除培養(yǎng)液,使用PBS將每孔細胞洗2次;每孔加入200 μl培養(yǎng)液和0.5%MTT 20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h;終止培養(yǎng),吸棄培養(yǎng)液,每孔加入150 μl二甲基亞砜,置搖床上避光低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解;在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值;每組5孔吸光度值平均后作為該組單次實驗結(jié)果。

1.5 Annexin Ⅴ-FLUOS染色檢測PASMCs凋亡

細胞干預(yù)完成后,吸取培養(yǎng)液,將原培養(yǎng)液移至另一1.5 ml離心管中,使用PBS將每孔細胞洗1遍,每孔加入胰酶消化細胞,室溫孵育1 min,吸走胰酶,將之前收集的每孔原培養(yǎng)液重新加入相應(yīng)孔,輕輕吹打,使細胞從6孔板脫離。將細胞轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中,200g離心5 min,收集細胞。棄上清,PBS重懸細胞,重懸細胞于100 μl的Annexin Ⅴ-FLUOS標(biāo)記溶液中,15-25 ℃孵育15 min。輕輕混勻熒光顯微鏡上進行分析。

1.6 Western blot檢測PPARγ蛋白水平

將PASMCs種植在6孔板中培養(yǎng),待細胞單層鋪滿孔底;細胞于無血清的DMEM培養(yǎng)基中孵育24 h;細胞干預(yù)完成后,提取蛋白并進行蛋白濃度測定及蛋白變性。10%聚丙烯酰氨凝膠電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫孵育1 h,anti-PPARγ抗體(1 ∶200)和anti-GAPDH抗體(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜。洗膜,二抗孵育1 h,洗膜,電化學(xué)發(fā)光試劑(Bio-Rad)暗室顯影。Quantity one軟件分析目的蛋白與內(nèi)參GAPDH蛋白灰度值,計算相對灰度值。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 5-HT對PASMCs增殖的影響

MTT及細胞計數(shù)分析結(jié)果顯示,與對照組比較,加入不同濃度(10-9,10-8,10-7,10-6,10-5mol/L)的5-HT干預(yù)后,5-HT能夠刺激PASMCs的增殖(P<0.05),其中10-6mol/L濃度促進PASMCs增殖的作用最明顯(見圖1)。

2.2 5-HT對PASMCs凋亡的影響

Annexin Ⅴ-FLUOS染色結(jié)果顯示,與對照組比較,加入不同濃度(10-9,10-8,10-7,10-6,10-5mol/L)的5-HT后,PASMCs凋亡數(shù)目顯著減少(P<0.01,見圖2),其中10-6mol/L抑制PASMCs凋亡的作用最明顯。

圖2 5-HT對PASMCs凋亡的影響Figure 2 Effect of 5-HT on the apoptosis of PASMCs

2.3 5-HT對PASMCs的PPARγ蛋白表達的影響

Westem blot結(jié)果顯示,與對照組比較,加入不同濃度(10-9,10-8,10-7,10-6,10-5mol/L)的5-HT后,PASMCs的PPARγ表達顯著減少(P<0.01),其中10-6mol/L組抑制PPARγ蛋白表達的作用最明顯(見圖3A)。10-6mol/L 5-HT刺激PASMCs不同時間后,與對照組比較,5-HT干預(yù)12 h即可使PPARγ表達減少(P<0.05),24 h時PPARγ表達降低更明顯(P<0.01,見圖3B)。

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01圖3 5-HT對PASMCs PPARγ蛋白表達的影響Figure 3 Effect of 5-HT on the PPARγ expression in PASMCs

2.4 PPARγ對5-HT干預(yù)的PASMCs增殖、凋亡的影響

與對照組比較,15d-PGJ2組和Ros組細胞增殖明顯減少(P<0.05),細胞凋亡明顯增加(P<0.05)。與5-HT組比較,5-HT+15d-PGJ2組和5-HT+Ros組細胞增殖顯著減少(P<0.01),細胞凋亡顯著增加(P<0.01)。與對照組比較,5-HT+15d-PGJ2+GW組和5-HT+Ros+GW組細胞增殖明顯增加(P<0.01),細胞凋亡明顯減少(P<0.01,見圖4,5)。

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與5-HT組比較,#P<0.05,##P<0.01;Ros:羅格列酮;GW:GW9662圖4 PPARγ對5-HT干預(yù)的PASMCs增殖的影響Figure 4 Effects of PPARγ on 5-HT-induced proliferation of PASMCs

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與5-HT組比較,#P<0.05,##P<0.01;Ros:羅格列酮;GW:GW9662圖5 PPARγ對5-HT干預(yù)的PASMCs凋亡的影響Figure 5 Effects of PPARγ on the 5-HT-induced apoptosis of PASMCs

3 討論

肺血管重構(gòu)是PAH過程的一個標(biāo)志,是一種以血管壁各層和多種細胞類型改變?yōu)樘卣鞯牟±頎顟B(tài),PASMCs在這一過程中發(fā)揮重要作用[11]。本研究以人PASMCs為研究對象,觀察了5-HT對PASMCs增殖和凋亡的影響及PPARγ在其中的作用。研究結(jié)果顯示,5-HT可促進PASMCs增殖、抑制凋亡,還可降低PASMCs中PPARγ的表達。此外,PPARγ的激活顯著抑制了5-HT誘導(dǎo)的PASMCs的增殖,促進了凋亡。

眾所周知,5-HT可引起肺動脈收縮,其在PAH和血管重塑的發(fā)病機制中發(fā)揮核心作用[12]。PASMCs的增殖和凋亡抑制增加,導(dǎo)致血管壁增厚和血管重塑是PAH的重要特征[13]。與之前的研究結(jié)果一致,本研究結(jié)果表明5-HT在體外培養(yǎng)的PASMCs中具有促進增殖和抑制凋亡的作用,提示5-HT在導(dǎo)致肺血管重構(gòu)中具有潛在的重要作用。

越來越多的證據(jù)表明,PPARγ能夠調(diào)節(jié)許多重要的細胞過程,如細胞增殖、分化和遷移[14]。而且既往的研究也顯示PPARγ對多種細胞類型的增殖和凋亡產(chǎn)生影響[15]。有研究報道了PPARγ的抗增殖和促凋亡作用,PPARγ可能作為抑癌基因發(fā)揮作用[16]。此外,也有研究發(fā)現(xiàn)PPARγ表達缺失能夠抑制內(nèi)皮細胞凋亡并促進細胞生長和血管生成,而PPARγ受體激動劑則能夠抑制血管平滑肌細胞(VSMCs)增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡[10]。在本研究中,我們觀察了PPARγ是否參與5-HT誘導(dǎo)的PASMCs的增殖和凋亡抑制。首先,我們觀察到5-HT以劑量和時間依賴性的方式降低了PASMCs中PPARγ的蛋白表達。PPAR-γ的激活需要與其配體結(jié)合實現(xiàn),而羅格列酮是PPARγ人工合成的配體,15d-PGJ2是PPARγ的天然配體。本研究發(fā)現(xiàn)特異性的PPARγ激動劑15d-PGJ2和羅格列酮均能夠顯著抑制5-HT誘導(dǎo)的促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用。GW9662是PPARγ的受體拮抗劑,通過與PPARγ配體結(jié)合袋中的賴氨酸殘基結(jié)合來永久抑制其他配體結(jié)合激活PPARγ。本研究結(jié)果顯示,GW9662能夠阻斷15d-PGJ2和羅格列酮對PASMCs增殖和凋亡的調(diào)控作用。以上這些發(fā)現(xiàn)與既往的研究一致,即PPARγ激動劑羅格列酮能抑制PASMC增殖和促進凋亡[17]。綜上所述,本研究結(jié)果表明PPARγ能夠抑制5-HT誘導(dǎo)的PASMC增殖,促進細胞凋亡。這一結(jié)果說明,PPARγ可能在肺血管重構(gòu)中扮演重要的角色,這也為其未來在PAH的預(yù)防、治療中發(fā)揮作用提供了新的理論依據(jù)。

本研究僅在體外水平對PPARγ參與肺血管重構(gòu)的機制進行了基礎(chǔ)探索,僅能初步說明PPARγ可能參與5-羥色胺促進肺動脈重構(gòu)的發(fā)生,然而在體內(nèi)復(fù)雜的病理生理環(huán)境中是否同樣還具有類似作用,需要在體及臨床研究進一步的驗證。