安慧仙,李 煒,方 東,孫 闖,張曉東,王 偉,李同華,曾廣偉*

(1西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院心臟病醫(yī)院心血管內(nèi)科,西安 710100;2西安市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:zengguangwei1026@163.com)

阿霉素(doxorubicin,DOX)是一種被廣泛使用的抗癌藥物,其常見適應(yīng)證包括血液癌癥(如白血病、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)和實體器官癌(如乳腺癌、甲狀腺癌、肉瘤、骨肉瘤等)[1-3]。然而,盡管DOX是治療不同類型癌癥的一線抗癌藥物,但DOX的治療會劑量依賴性地引起嚴重心臟毒性和耐藥性,這成為限制DOX臨床應(yīng)用的主要瓶頸因素。DOX導(dǎo)致的心臟毒性可表現(xiàn)為急性心臟損傷,也可表現(xiàn)為慢性的左室功能障礙、擴張型心肌病和心力衰竭[4]。而急性心臟毒性與心肌細胞質(zhì)空泡化、線粒體膜脂質(zhì)過氧化和腫脹、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)增加以及染色質(zhì)和DNA結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)[5,6]。此外,DOX導(dǎo)致的線粒體、肌質(zhì)網(wǎng)等細胞器以及大分子損傷和ATP含量的降低均能啟動自噬過程。因此,探討自噬在DOX誘發(fā)心臟毒性中的作用,并尋找可以防治DOX心臟毒性的藥物對于DOX的臨床應(yīng)用至關(guān)重要。

促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)是一種內(nèi)源性蛋白,臨床上用于治療由慢性腎病、人類免疫缺陷病毒和化療引起的貧血,這種激素也被用來限制手術(shù)輸血的次數(shù)[7,8]。盡管EPO對很多器官組織有保護作用,但需要很高的劑量,這會引發(fā)嚴重的副作用,如血栓形成、中風(fēng)和高血壓。螺旋B表面肽(helixb surface peptide,HBSP)是從EPO螺旋B的水表面衍生出來的11個氨基酸序列,最近被證明具有很強的心血管保護作用[9]。長期服用HBSP可改善心肌梗死后擴張型心肌病的進展[10]。同時,最新研究表明HBSP能通過激活PI3K/Akt信號改善表柔比星誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷[11]。然而HBSP在改善DOX誘發(fā)的心臟毒性中的作用及機制還未見報道,有待進一步研究。因此,本研究采用小鼠腹腔注射DOX,探討HBSP對DOX誘發(fā)心臟毒性的保護作用及對自噬的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

36只8周齡健康雄性C57BL/6小鼠購買于西安交通大學(xué)實驗動物中心,體質(zhì)量25-30 g。HBSP購買于上?？齐纳锟萍加邢薰?依據(jù)文獻確定其濃度[12],肌鈣蛋白T(cTnT)試劑盒購于南京建成生物公司,DOX購買于Sigma公司,Caspase-3、cytochrome C、cleaved Caspase-3、Caspase-9、LC3B、Beclin1、LAMP2和p62抗體購買于Cell Signaling Technology公司,β-actin、山羊抗兔和山羊抗鼠抗體購買于北京中衫金橋公司。

1.2 實驗分組和建立動物模型

將購買的36只C57BL/6小鼠在動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,為了觀察HBSP對DOX心臟毒性的作用,將小鼠隨機分為3組,每組12只:①對照組(control):腹腔注射生理鹽水;②DOX組:一次性腹腔注射DOX(15 mg/kg);③DOX+HBSP組:一次性腹腔注射DOX(15 mg/kg),并腹腔注射30 μg/(kg·d)的HBSP,連續(xù)7 d。模型建立的方法和藥物注射濃度均參照以往文獻的報道[9,12]。

1.3 心臟血流動力學(xué)指標(biāo)的檢測

DOX引起心臟功能損傷是其誘發(fā)心臟毒性的一個重要表現(xiàn)。DOX注射7 d后,用異氟烷麻醉小鼠,體視顯微鏡下分離頸動脈,穿線結(jié)扎遠端,在頸動脈做一小切口,將連有壓力傳感器的動脈套管針沿切口插入頸動脈至心室,采用多道生理記錄儀測量左室壓力上升最大速率(+dP/dtmax)和左室壓力下降最大速率(-dP/dtmax),檢測各組小鼠心臟的收縮和舒張功能。

1.4 心臟HE染色檢測心臟結(jié)構(gòu)

DOX會引起心臟結(jié)構(gòu)的病理性改變,DOX注射7 d后,用異氟烷麻醉小鼠,快速取出心臟放置于預(yù)冷PBS中沖洗以去除血液,再將心臟放入4%多聚甲醛過夜固定;常規(guī)脫水復(fù)蠟、石蠟包埋和切片;二甲苯和梯度酒精脫蠟復(fù)水,采用常規(guī)蘇木精和尹紅染色方法,中性樹膠封片。普通光學(xué)顯微鏡觀察各組染色情況。

1.5 ELISA檢測血清中cTnT的含量

DOX注射7 d后,用異氟烷麻醉小鼠,將小鼠固定在手術(shù)臺上,剪開頸部皮膚,暴露頸動脈并剪口取血;2 000g離心10 min,取上清凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。嚴格按照南京建成生物公司cTnT檢測試劑盒說明書操作,分光光度計讀取各組血清的吸光值并計算出各組血清cTnT的含量。

1.6 Western blot檢測Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-9、cytochrome C、Beclin1、P62、LAMP2和LC3B蛋白的表達

稱取各組小鼠相同質(zhì)量的左室組織,先用預(yù)冷的PBS 2 000g離心10 min,棄上清,沉淀中按照1 ∶5的比例加入裂解液(含蛋白酶抑制劑和RIPA),用研磨器在冰上研磨裂解30 min,12 000g、4 ℃離心30 min,保留上清,BCA法蛋白定量;配制SDS-PAGE膠,每孔上樣40 μg,常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜;5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,將目的蛋白剪下并放入相應(yīng)的抗體管中:Caspase-3(1 ∶1 000)、cleaved Caspase-3(1 ∶1 000)、Caspase-9(1 ∶1 000)、cytochrome C(1 ∶1 000)、Beclin1(1 ∶1 000)、P62(1 ∶1 000)、LAMP2(1 ∶1 000)、LC3B(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶5 000),4 ℃過夜;次日,TBST洗滌3次,每次10 min,用HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h,TBST洗滌3次,每次10 min;Bio-rad發(fā)光儀化學(xué)發(fā)光,并用Image Lab軟件對條帶灰度進行分析并統(tǒng)計,β-actin作為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 HBSP改善DOX誘發(fā)的心臟功能損傷

與control組比較,DOX組小鼠心臟+dP/dt和-dP/dt明顯降低(P<0.05),說明DOX組小鼠心臟收縮和舒張功能均受損;與DOX組比較,HBSP+DOX組HBSP處理后+dP/dt和-dP/dt明顯增加(P<0.05,見圖1),表明HBSP能改善DOX誘發(fā)的心臟功能損傷。

與control組比較,*P<0.05;與DOX組比較,#P<0.05圖1 各組心臟功能的比較Figure 1 Comparison of cardiac function among three groups

2.2 HBSP改善DOX誘發(fā)的心臟形態(tài)損傷

由HE染色和血清cTnT檢測結(jié)果可以看出,control組心肌纖維排列整齊,沒有空泡化現(xiàn)象,血清中cTnT含量很低;而DOX組心肌纖維出現(xiàn)部分斷裂、排列不規(guī)則并出現(xiàn)空泡化,同時血清中cTnT含量明顯增加(P<0.05,見圖2);與DOX組比較,HBSP+DOX組HBSP處理后心肌纖維排列、減輕空泡化明顯改善,并血清中cTnT含量明顯降低(P<0.05,見圖2)。

與control組比較,*P<0.05;與DOX組比較,#P<0.05圖2 各組小鼠心臟形態(tài)和血清cTnT含量的比較Figure 2 Comparison of cardiac structure and serum cTnT content among three groups

2.3 HBSP抑制DOX誘發(fā)的心肌細胞凋亡

Western blot結(jié)果可以看出,與control組相比,DOX組cleaved Caspase-3、Caspase-3、Caspase-9和cytochrome C的表達明顯增加(P<0.05);與DOX組比較,HBSP+DOX組HBSP處理后cleaved Caspase-3、Caspase-3、Caspase-9和cytochrome C的表達明顯減少(P<0.05,見圖3)。

與control組比較,*P<0.05;與DOX組比較,#P<0.05圖3 各組cleaved Caspase-3、Caspase-3、Caspase-9和cytochrome C的表達Figure 3 Expression of cleaved Caspase-3, Caspase-3, Caspase-9 and cytochrome C in each group

2.4 HBSP抑制DOX誘發(fā)的心肌細胞自噬

與control組相比,DOX組LC3BⅡ/LC3BⅠ比值、Beclin1、P62和LAMP2的表達明顯增加(P<0.05);與DOX組比較,HBSP+DOX組HBSP處理后LC3BⅡ/LC3BⅠ比值、Beclin1、P62和LAMP2的表達明顯降低(P<0.05,見圖4),這說明HBSP能改善DOX引起的心肌細胞自噬功能障礙。

與control組比較,*P<0.05;與DOX組比較,#P<0.05圖4 各組Beclin1、P62和LAMP2的表達以及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值的比較Figure 4 Expression of Beclin1, P62 and LAMP2 and the ratio of LC3BⅡ/LC3BⅠ in each group

3 討論

DOX的心臟毒性和耐藥性嚴重制約了DOX作為抗癌藥物的臨床應(yīng)用。盡管以往的很多報道提出了一些研究理論[13],以更好地闡明DOX誘導(dǎo)的心臟毒性和耐藥性的機制,但遺憾的是,還沒有一個明確的潛在機制轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。DOX心臟毒性作用相關(guān)的兩個比較明確和主要的機制包括自由基的生成以及對細胞DNA和不同細胞內(nèi)蛋白的損傷,破壞拓撲異構(gòu)酶介導(dǎo)的DNA修復(fù)[14,15]。另外,鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、線粒體損傷和凋亡也被認為是DOX誘發(fā)心臟毒性的重要因素。

DOX劑量依賴的心臟毒性會導(dǎo)致不可逆心力衰竭,然而其病理機制尚未完全闡明。使用DOX治療時,很多患者會出現(xiàn)左心室功能進行性降低,并最終進展為充血性心力衰竭。而左室功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷是DOX導(dǎo)致心臟毒性的重要病理表現(xiàn)[16]。在本實驗中,DOX腹腔注射7 d后,小鼠心臟+dP/dt和-dP/dt明顯降低,同時,心肌纖維部分斷裂并出現(xiàn)空泡化,血清中cTnT含量明顯增加,說明DOX能損傷心臟的收縮和舒張功能,并導(dǎo)致心肌纖維病理性改變。而給予HBSP處理后,小鼠心臟+dP/dt和-dP/dt顯著增加,心肌纖維結(jié)構(gòu)改善,空泡化減少,血清中cTnT含量降低。這些結(jié)果證明HBSP能改善DOX引起的心臟毒性。

越來越多的證據(jù)表明[17],DOX會引起心肌細胞凋亡,導(dǎo)致心肌細胞數(shù)量減少[18]。作為促凋亡蛋白,Caspase-9可以活化并剪切Caspase-3成為cleaved Caspase-3,同時,Caspase-9和cytochrome C形成凋亡體并介導(dǎo)cytochrome C由線粒體釋放到胞質(zhì),這些過程在細胞凋亡中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[19]。本實驗結(jié)果表明,DOX處理后cleaved Caspase-3、Caspase-3、Caspase-9和cytochrome C的蛋白表達明顯增加,說明心肌細胞凋亡增加,這與以往的研究結(jié)果一致[6]。而給予HBSP處理,可使cleaved Caspase-3、Caspase-3、Caspase-9和cytochrome C的蛋白表達明顯降低,這說明HBSP能明顯減輕DOX誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。

自噬是真核細胞中一種保守的循環(huán)利用受損細胞器和蛋白質(zhì)的機制,由溶酶體介導(dǎo)的一種分解代謝途徑,在維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細胞存活中起著至關(guān)重要的作用[20]。完整的自噬過程即自噬流包括自噬小體的形成,與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體以及將自噬溶酶體內(nèi)的底物降解,而LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin1、P62和LAMP2在自噬的這幾個階段發(fā)揮了關(guān)鍵作用,是自噬流檢測的標(biāo)志蛋白[21]。自噬參與多種生理和病理過程,包括抗衰老、腫瘤抑制、蛋白質(zhì)質(zhì)量控制和細胞死亡調(diào)控。根據(jù)以往報道,自噬功能受損,無論是自噬抑制或過度激活,都會損害心臟功能[22]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),DOX腹腔注射7 d后會導(dǎo)致自噬相關(guān)蛋白LC3BⅡ/LC3BⅠ比值、Beclin1、P62和LAMP2的表達明顯增加;而HBSP處理后可顯著降低LC3BⅡ/LC3BⅠ比值、Beclin1、P62和LAMP2的表達,這說明HBSP可改善DOX引起的自噬流功能障礙。因此,這些結(jié)果表明HBSP調(diào)控自噬可能是治療DOX誘導(dǎo)心臟毒性的潛在策略。

綜上所述,本實驗的結(jié)果表明細胞凋亡和過度自噬是DOX誘導(dǎo)心臟毒性的重要機制。而HBSP可以減輕DOX誘導(dǎo)的心臟毒性,其發(fā)揮保護作用的機制是通過抑制細胞凋亡和過度自噬實現(xiàn)的。本研究為闡明DOX誘導(dǎo)心臟毒性的機制提供了實驗證據(jù),并為HBSP治療DOX誘導(dǎo)的心臟毒性提供了新的實驗和理論依據(jù)。