翟曉艷,楊李旺,楊 蓉,趙煥新,季新艷,周儒奎

(1山西中醫(yī)藥大學(xué)解剖教研室,太原 030016;2山西中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室;3山西中醫(yī)藥大學(xué)生理教研室)

近年來,世界各國的心血管疾病的發(fā)病率呈上升趨勢,其中冠心病率約為50%,已嚴(yán)重影響全人類的生命健康[1]。冠心病中心肌梗死作為常見的嚴(yán)重類型,病發(fā)期間多伴有免疫功能紊亂,嚴(yán)重影響患者的心功能以及缺血病程進展。因此,適當(dāng)?shù)拿庖哒{(diào)節(jié)劑可能為治療相關(guān)疾病開辟一條藥物介入途徑。陳玲玲等[2]研究黃芩苷預(yù)處理對心肌缺血/再灌注損傷大鼠,發(fā)現(xiàn)其能抵抗更長時間的以上損傷,儲備更強的內(nèi)源性抗氧化損傷能力。此外,黃浪等[3]研究顯示,黃芩苷可改善心功能,抑制心肌細胞凋亡,機制可能與其降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子表達有關(guān),但他們均沒有深入分析相關(guān)的心肌組織蛋白損失機制及其對細胞凋亡率與免疫功能的影響。臨床上尋找新的防治藥物或方案仍是研究的熱點問題?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,中藥黃芩苷已在各種心血管疾病治療中發(fā)揮重要的作用,表現(xiàn)出抗炎、免疫調(diào)節(jié)以及保護心肌細胞的作用[4]。本研究深入分析了黃芩苷藥理作用的療效,系統(tǒng)研究黃芩苷作用的可能機制,為中藥學(xué)應(yīng)用于相關(guān)的心血管疾病提供了堅實的實驗基礎(chǔ)和理論科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

機將24只SD大鼠(南京君科生物工程有限公司，體質(zhì)量230-250 g)分為假手術(shù)組、模型組與黃芩苷組，每組8只。其中假手術(shù)組采用絲線穿至左前降支根部，但不結(jié)扎，模型組、黃芩苷組大鼠采用結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支近端的方法進行建模。

1.2 建立心肌梗死模型

SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉,頸部去毛,分離氣管,連接麻醉呼吸機,連接心電圖導(dǎo)聯(lián),開胸后進行輔助呼吸,暴露心臟,5/0號細線結(jié)扎冠狀動脈左前降支起始端,并快速放回胸腔,排氣,閉胸。造模當(dāng)天開始灌胃，1次/d， 持續(xù)30 d，其中假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，黃芩苷組給予100 mg/kg黃芩苷(上海純優(yōu)生物科技有限公司,CAS:21967-41-9)。

1.3 心功能狀況

采用彩色多普勒超聲心動圖(美國Acuson SEQUOIA 521)評估各組大鼠心功能指標(biāo)心率(HR)、左心室舒張末壓(LVEDP)及左心室收縮壓(LVSP)情況。

1.4 蘇木素-伊紅(HE)染色檢測組織形態(tài)學(xué)變化

采用頸部脫臼法處死大鼠,提取部分心臟,采用4%甲醛緩沖液固定,進行切片、脫蠟、乙醇水合處理、染色(碧云天提供的試劑盒)、封片,最后光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)。

1.5 細胞凋亡的檢測

采用TUNEL法嚴(yán)格根據(jù)試劑盒步驟檢測大鼠心肌細胞凋亡情況,計算細胞凋亡率。

1.6 蛋白免疫印跡法檢測心肌組織蛋白表達

采用化學(xué)發(fā)光顯影測定、拍照,借助自帶軟件分析大鼠心肌組織中蛋白酶激活受體2(PAR-2)、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X(Bax)蛋白的表達水平。使用蛋白裂解液裂解粉碎的大鼠心肌組織,提取總蛋白,行10% SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜,封閉。加入(PAR-2、Bcl-2、Bax抗體,以TBS稀釋,濃度分別為1 ∶500,1 ∶500,1 ∶200)一抗,置于4 ℃孵育過夜;加入二抗,室溫下孵育1 h。其中,β-actin為內(nèi)參照檢測PAR-2表達水平,GAPDH為內(nèi)參照檢測Bcl-2、Bax蛋白表達水平。半定量結(jié)果為目的條帶與內(nèi)參照條帶吸光度比值。

1.7 免疫功能

采集大鼠頸動脈血,采用流式細胞儀(美國貝克曼DxFLEX型)檢測T淋巴細胞亞群(CD3、CD4、CD8、CD4/CD8)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠心功能指標(biāo)LVSP、LVEDP和HR比較

三組間大鼠的HR比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心功能指標(biāo)LVSP明顯降低,LVEDP明顯提高(P<0.05);與模型組比較,黃芩苷組大鼠心功能指標(biāo)LVSP明顯升高,LVEDP均明顯降低(P<0.05,見表1)。

表1 三組大鼠心功能指標(biāo)LVSP、LVEDP與HR比較

2.2 三組大鼠心肌組織蛋白Bcl-2、Bax、PAR-2表達水平比較

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌組織蛋白Bax、PAR-2均明顯提高,Bcl-2明顯降低,差異有統(tǒng)計有意義(P<0.05);與模型組比較,黃芩苷組大鼠心肌組織蛋白Bax、PAR-2均明顯降低,Bcl-2明顯提高,差異有統(tǒng)計有意義(P<0.05,見表2與圖1)。

表2 三組大鼠心肌組織蛋白Bcl-2、Bax、PAR表達水平比較

圖1 三組大鼠心肌組織蛋白Bcl-2、Bax、PAR表達水平的蛋白免疫印跡Figure 1 Expression levels of Bcl-2, Bax and PAR in myocardial tissues of rats in three groups by Western blot

2.3 三組大鼠免疫功能淋巴細胞總數(shù)及亞群變化比較

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠CD3+、CD4+、CD8+均明顯提高,而CD4+/CD8+明顯降低,差異有統(tǒng)計有意義(P<0.05);與模型組比較,黃芩苷組CD3+、CD8+明顯降低,CD4+/CD8+明顯提高,差異有統(tǒng)計有意義(P<0.05),黃芩苷組CD4+比較稍微上升,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表3)。

表3 三組大鼠免疫功能淋巴細胞總數(shù)及亞群變化比較

2.4 三組大鼠心肌細胞凋亡率比較

模型組大鼠的心肌細胞凋亡率明顯高于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計有意義(P<0.05);黃芩苷組大鼠心肌細胞凋亡率明顯低于模型組,差異有統(tǒng)計有意義(P<0.05,見表4)。

表4 三組大鼠心肌細胞凋亡率比較

2.5 三組大鼠心肌組織病理學(xué)HE染色比較

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌細胞顯著損傷,心肌纖維排列紊亂,部分出現(xiàn)斷裂、分離;與模型組比較,黃芩苷組大鼠損傷的心肌細胞數(shù)量顯著減少,心肌細胞呈現(xiàn)較小但排列較規(guī)則,心肌纖維較完整,心肌組織病理損傷程度顯著減輕(見圖2)。

圖2 三組大鼠心肌組織病理學(xué)HE染色 (×50)Figure 2 Histopathological changes of myocardium of rats in the three groups by HE staining (×50)

3 討論

急性心肌梗死已經(jīng)成為對人類生命安全產(chǎn)生嚴(yán)重影響的主要疾病之一。一些研究表明,心肌細胞在不斷的缺血、缺氧以及缺血再灌注過程中不僅出現(xiàn)細胞損傷、壞死,還會引起心肌細胞凋亡,對心功能產(chǎn)生嚴(yán)重的影響[5,6]。基因調(diào)控的細胞凋亡在心肌梗死疾病中心肌細胞凋亡路徑相關(guān)基因表達水平高低存在直接的關(guān)聯(lián)。但是在不同的因素作用下,機體可能存在不同的調(diào)控基因來誘導(dǎo)心肌細胞凋亡,因此傳導(dǎo)細胞凋亡通路可能存在多條,但是這些通路之間保持著一定的相互作用與關(guān)聯(lián)[7,8]。一旦機體啟動細胞凋亡,機體會通過細胞內(nèi)酶促級聯(lián)反應(yīng)顯著地改變細胞形態(tài),同時調(diào)控相關(guān)的生化指標(biāo)水平高低,從而影響細胞凋亡狀態(tài)[9]。發(fā)生心肌梗死后,缺血性應(yīng)激作用會誘導(dǎo)梗死邊緣的心肌細胞凋亡數(shù)量顯著上升,導(dǎo)致心室重構(gòu),嚴(yán)重者發(fā)生心力衰竭,因此臨床治療心肌梗死疾病通過降低心肌細胞凋亡率來提高患者生存率的意義重大。

黃芩苷藥理作用在近年來陸續(xù)被開發(fā)與研究,主要表現(xiàn)在抗氧化、抗炎、抗過敏等方面,同時具有保護機體的免疫系統(tǒng)等[10,11]。近年關(guān)于黃芩苷在心、腦血管系統(tǒng)作用的實驗研究日益增多,王震雨等[12]研究顯示,野黃芩苷減輕腦缺血損傷的作用主要是促進了新血管的生成。歐紅令等[13]研究表明,病毒性心肌炎小鼠給予黃芩苷灌胃可抑制心肌細胞凋亡,其機制可能是通過抑制Cyt C/Caspase-9/Caspase-3凋亡信號通路表達與活化,進而提高心肌細胞線粒體膜電位,減輕線粒體損傷,從而改善病毒性心肌炎。此外,免疫細胞因子異常升高不僅會抑制心肌細胞功能,還會導(dǎo)致心肌損傷、心肌重構(gòu)等[14]。許多研究顯示,心肌缺血或心力衰竭患者的CD4+/CD8+值會明顯低于正常健康者,同時免疫功能也較低,且與疾病的嚴(yán)重程度存在正相關(guān)性[15,16]。而本研究采用的黃芩苷對機體的免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用,結(jié)果顯示黃芩苷治療大鼠的CD4+/CD8+值與病理模型大鼠存在明顯的差異,但與正常大鼠較接近,這提示黃芩苷可以改善心肌梗死疾病的免疫功能。

PARP-1具有調(diào)控細胞生長、凋亡等作用,在生物細胞中分布較多,而PAR-2是其活性形式之一[17]。此外,機體內(nèi)調(diào)控細胞凋亡會存在如凋亡抑制因子與誘導(dǎo)因子等因子參與細胞生理過程[18]。Bcl家族中,Bax是Bcl-2的同源體,而促凋亡因子Bax與抑制凋亡因子Bcl-2等均參與細胞凋亡通路的調(diào)節(jié),其中抑制Bcl-2會誘使細胞加速凋亡。對于Bax促進細胞凋亡可能機制為:Bax會促進細胞凋亡,同時抑制同源體Bcl-2作用,降低細胞色素C水平,加速細胞凋亡[18,19]。此外,凋亡抑制基因Bcl-2抑制多種因素誘導(dǎo)的細胞凋亡,也會降低缺血再灌注心肌細胞的凋亡率[19]。本研究結(jié)果顯示,與心肌梗死模型大鼠比較,黃芩苷可以明顯降低心肌梗死模型大鼠心肌組織蛋白Bax、PAR-2表達水平,提高Bcl-2表達水平,以及心功能指標(biāo)LVSP、LVEDP均明顯改善,這提示其有助于抑制心肌細胞凋亡路徑與心功能機能,同時本研究也顯示心肌細胞的凋亡率明顯降低,以上結(jié)果綜合表明黃芩苷有助于改善心肌梗死的病情,減輕心肌損傷,保護心功能的作用。

綜上所述,黃芩苷有助于改善心梗疾病心功能,降低心肌細胞凋亡率,同時改善心肌組織的免疫功能,可能作用機制為上調(diào)Bcl-2、PAR-2蛋白水平,下調(diào)Bax蛋白表達,抑制心梗后心肌細胞凋亡率,發(fā)揮保護心肌細胞的作用。