聶尊珍,郭 英,陳 佳,田 怡,楊 軍*

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科,西安 710004;2西安大興醫(yī)院病理科;*通訊作者,E-mail:yangjundr@163.com)

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用[1,2]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumour associated macrophages,TAMs)可分為CD68陽性的M1型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(CD68+TAMs)和CD163陽性的M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(CD163+TAMs)[3,4]。CD47是免疫球蛋白(Ig)超家族中的重要成員,也被稱為整合素相關(guān)蛋白(integrin-associated protein,IAP),是一種在人體多種正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面均廣泛表達(dá)的跨膜蛋白。CD47可通過與吞噬細(xì)胞表面的信號調(diào)節(jié)蛋白α(signal regulatory protein α,SIRPα)結(jié)合而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬能力[5]。現(xiàn)已明確,巨噬細(xì)胞和CD47分別是直接參與腫瘤免疫全過程的重要免疫相關(guān)細(xì)胞和分子。而且,CD47已成為繼程序性細(xì)胞死亡蛋白-1(programmed death-1,PD-1)和程序性細(xì)胞死亡蛋白配體-1(programmed death ligand 1,PD-L1)及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4,CTLA-4)之后,腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。胃癌是最常見的上消化道惡性腫瘤,盡管腫瘤防治技術(shù)已獲得了長足進(jìn)步,但進(jìn)展期胃癌總體療效仍未見明顯改善。因此,探索胃癌免疫治療新方法具有重要臨床價值。該研究擬采用免疫組化法研究CD47表達(dá)與胃癌微環(huán)境中浸潤的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞類型和分級間的相關(guān)性,以期闡明胃癌的腫瘤免疫特征,為探索胃癌免疫治療新方法提供堅(jiān)實(shí)的病理學(xué)證據(jù)。

1 臨床資料和方法

1.1 臨床資料

選取西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科2017-2020年術(shù)前均未經(jīng)治療的手術(shù)切除胃腺癌樣本78例。所有樣本均經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定、石蠟包埋切片、HE染色行病理學(xué)診斷。其中,男性61例、女性17例,平均61歲,高-中分化腺癌33例、低分化腺癌45例。TNM Ⅰ-Ⅱ期病例28例、Ⅲ-Ⅳ期病例50例,伴轉(zhuǎn)移病例45例、未轉(zhuǎn)移病例33例。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

抗CD47抗體(克隆號:3019)及抗CD163抗體(克隆號:EPR19518),購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司(cambridge,MA,USA;Abcam),抗體按1 ∶300稀釋使用?？笴D68即用型抗體(克隆號:KP1)購自福州邁新生物技術(shù)有限公司(中國)。用已知CD47陽性的腺癌樣本作為CD47免疫組化染色的陽性對照。用扁桃體樣本作為CD68、CD163免疫組化染色的陽性對照。

1.3 方法

1.3.1 采用免疫組化檢測CD68、CD163及CD47在胃癌樣本中的表達(dá) 將包含有胃癌組織、癌旁組織的石蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片,二甲苯脫蠟、復(fù)水后,采用pH 9.0的EDTA進(jìn)行抗原修復(fù)20 min,PBS沖洗后滴加3% H2O210 min,PBS沖洗后分別滴加100 μl的抗CD47、CD68、CD163抗體,37 ℃孵育60 min,PBS沖洗后加100 μl酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物,室溫孵育15 min,PBS沖洗后DAB顯色,蘇木素復(fù)染,二甲苯透明,中性樹膠封固。

1.3.2 結(jié)果判讀 CD47免疫組化染色結(jié)果[6]判讀:0(陰性):細(xì)胞膜無著色,或僅有細(xì)胞質(zhì)著色;1+(弱陽性):任何比例細(xì)胞呈現(xiàn)微弱、不完整膜著色;2+(陽性):>10%的細(xì)胞呈現(xiàn)弱至中等強(qiáng)度、完整但不均勻膜棕黃著色;3+(強(qiáng)陽性):>30%的細(xì)胞呈現(xiàn)完整膜強(qiáng)的棕褐著色。0和1+為低表達(dá),2+和3+為高表達(dá)。

CD68、CD163免疫組化染色結(jié)果判讀:在光學(xué)顯微鏡下分別觀察癌組織、癌旁組織的CD68或CD163免疫組化染色切片,胞漿中出現(xiàn)特異性棕黃色顆粒的細(xì)胞分別判定為CD68+TAMs或CD163+TAMs。選取腫瘤微環(huán)境或?qū)φ盏陌┡越M織黏膜層陽性巨噬細(xì)胞最為密集的5個高倍視野(×200),分別計(jì)數(shù)浸潤的CD68+TAMs和CD163+TAMs細(xì)胞數(shù),并計(jì)算其平均值進(jìn)行分級:以顯微鏡下腫瘤微環(huán)境中浸潤的CD68或CD163陽性巨噬細(xì)胞數(shù)≤60個/HPF為低級別,>60個/HPF為高級別。同時,計(jì)算CD163+TAMs細(xì)胞數(shù)與CD68+TAMs細(xì)胞數(shù)的比值,CD163/CD68≤1為低比值,>1為高比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行結(jié)果分析。癌組織及癌旁組織CD47、CD68、CD163表達(dá)結(jié)果的分析采用配對卡方檢驗(yàn),對癌組織CD47、CD68、CD163的表達(dá)與臨床病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性采用卡方檢驗(yàn)方法,以P<0.05判讀為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD47、CD68和CD163在胃癌組織中的表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示,CD47呈質(zhì)膜型表達(dá),在胃癌細(xì)胞和胃癌間質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)明顯強(qiáng)于其在癌旁胃黏膜腺體和間質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)水平。CD68和CD163呈胞質(zhì)型表達(dá),胃癌組織中浸潤C(jī)D68+TAMs和CD163+TAMs分級也均顯著高于癌旁組織中浸潤C(jī)D68+TAMs和CD163+TAMs分級,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。但CD163/CD68比值在胃癌及癌旁組織中的差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1,表1)。

A.胃癌組織HE染色切片;B.癌旁組織HE染色切片;C.CD47在胃癌組織中癌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞上呈質(zhì)膜型強(qiáng)陽性表達(dá)(3+);D.CD47在正常腺上皮細(xì)胞和散在的少數(shù)間質(zhì)細(xì)胞中呈質(zhì)膜型弱陽性表達(dá)(1+);E.CD68+TAMs在胃癌組織微環(huán)境中密集分布;F.CD68+TAMs在胃癌癌旁組織中散在分布;G.CD163+TAMs在胃癌組織微環(huán)境中密集分布;H.CD163+TAMs在胃癌癌旁組織中散在分布圖1 免疫組化檢測CD47、CD68、CD163在胃癌樣本中的表達(dá) (×200)Figure 1 Expression of CD47, CD68 and CD163 in gastric cancer tissues by immunohistochemical staining (×200)

表1 胃癌組織和癌旁組織中CD47、CD68、CD163的表達(dá) 例(%)

2.2 CD47、CD68和CD163的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性

結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD47在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者胃癌細(xì)胞上的表達(dá)較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的表達(dá)顯著增高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時,CD47在胃癌細(xì)胞上的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(見表2)。但是,胃癌組織和癌旁組織中浸潤C(jī)D68+TAMs和CD163+TAMs分級及CD163/CD68比值與性別、年齡、TNM分期、組織學(xué)分級、是否轉(zhuǎn)移等臨床病理學(xué)特征之間均無相關(guān)性(見表3,4)。

表2 CD47在胃癌和癌旁組織中的表達(dá) (例)

表3 胃癌組織中浸潤C(jī)D68+TAMs和CD163+TAMs分級與胃癌臨床特征的相關(guān)性 (例)

表4 胃癌組織及癌旁組織中CD163/CD68比值(界值1) (例)

3 討論

腫瘤微環(huán)境在腫瘤進(jìn)展及免疫治療中發(fā)揮重要作用。CD47是重要免疫檢查點(diǎn)蛋白[7,8]。腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中重要的免疫活性細(xì)胞。因此,研究CD47表達(dá)與腫瘤微環(huán)境中浸潤巨噬細(xì)胞的相關(guān)性對于闡明腫瘤免疫機(jī)制、探索腫瘤免疫治療新方法具有重要價值?，F(xiàn)已明確,CD47在包括造血細(xì)胞等正常組織和膀胱癌、星形細(xì)胞瘤、前列腺癌、平滑肌肉瘤、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、急性髓細(xì)胞白血病(AML)和急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)等細(xì)胞中均呈強(qiáng)陽性高表達(dá),并在細(xì)胞增殖、凋亡、黏附、遷移等多種細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用[9-13]。而SIRPα屬于免疫球蛋白超家族的成員,在髓系細(xì)胞,如巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和髓系樹突狀細(xì)胞膜上高度表達(dá)。癌細(xì)胞表面高表達(dá)的CD47可通過與巨噬細(xì)胞表面高表達(dá)的SIRPα結(jié)合,并經(jīng)由CD47/SIRPα通路抑制巨噬細(xì)胞的吞噬功能,從而介導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸[14]。采用抗CD47抗體阻斷CD47/SIRPα軸,可增加巨噬細(xì)胞在腫瘤間質(zhì)內(nèi)的浸潤,并激活巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬能力。同時,抑制CD47/SIRPα軸,并聯(lián)合與腫瘤靶向抗體或化療、放療,可促進(jìn)癌細(xì)胞死亡和提高生存率[14-16]。因而,CD47被認(rèn)為是顯性巨噬細(xì)胞檢查點(diǎn)[8]。

眾所周知,CD68是M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物,CD163是M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物[17-19]。既往研究認(rèn)為,胰腺癌中CD47的高表達(dá)與腫瘤微環(huán)境中浸潤的CD68陽性的M1巨噬細(xì)胞分級相關(guān),而與浸潤的CD163陽性的M2巨噬細(xì)胞的分級無關(guān)[20]。但是,本研究發(fā)現(xiàn)CD47在胃癌細(xì)胞和胃癌微環(huán)境間質(zhì)細(xì)胞中的高表達(dá),且表達(dá)強(qiáng)度明顯高于癌旁胃黏膜腺體和間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá),并與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這與既往研究發(fā)現(xiàn)CD47過表達(dá)可顯著促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的結(jié)論一致[9]。同時,本研究顯示CD47在胃癌間質(zhì)中的表達(dá)與年齡有關(guān),但顯然這缺乏必要的理論依據(jù),因而推測很可能與該研究樣本量小有關(guān)。

此外,既往研究認(rèn)為胃癌組織與癌旁組織中浸潤的CD163+TAMs和CD68+TAMs的比值(CD163/CD68)能反映出腫瘤微環(huán)境中浸潤的M2與M1型巨噬細(xì)胞之間的數(shù)量比,并可依此評估腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫功能狀態(tài)。盡管本研究還發(fā)現(xiàn)胃癌組織微環(huán)境中浸潤的CD68+TAMs和CD163+TAMs分級顯著高于癌旁組織中的浸潤巨噬細(xì)胞分級。但是,胃癌組織與癌旁組織中CD163/CD68比值卻并無顯著性差異。因而,采用CD163/CD68評估胃癌區(qū)域微環(huán)境的免疫狀態(tài)尚缺乏足夠依據(jù)。

總之,該研究發(fā)現(xiàn),胃癌細(xì)胞中CD47的高表達(dá)和胃癌組織微環(huán)境中浸潤的CD68+TAMs和CD163+TAMs是胃癌普遍性的共性免疫微環(huán)境特征,且不受年齡、性別、腫瘤的組織學(xué)分級及TNM分期的影響。而且檢測CD47的表達(dá)和胃癌微環(huán)境中浸潤的CD68+TAMs和CD163+TAMs分級可用于評估胃癌的免疫狀態(tài)。