李建明 熊潤(rùn)松 彭麗珊 王登嶸 楊 洋 劉 顯 伍月榕 梁镕伊 梁淑家 肖 健,5

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)1 免疫學(xué)教研室，2 公共管理學(xué)院，南寧市 530020，電子郵箱：747110356@qq.com；3 重慶市武隆區(qū)疾病預(yù)防控制中心地方病與慢性病健康教育科，重慶市 408500；4 廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心艾滋病防制科，南寧市 530000；5 廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧市 53022)

AIDS是由HIV-1感染所致，HIV-1入侵宿主后導(dǎo)致CD4+T淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞的免疫應(yīng)答失調(diào)[1-3]，且能在外周血和淋巴組織中檢測(cè)到這些異常應(yīng)答。HIV-1直接或間接地作用于免疫系統(tǒng)，進(jìn)行性破壞免疫系統(tǒng)[4]，使得CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量降低、功能缺陷，進(jìn)而影響B(tài)淋巴細(xì)胞的活化及抗體的分泌，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能失調(diào)[5]。HIV-1為逆轉(zhuǎn)錄病毒，因此抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(antiretroviral therapy，ART)可極大程度地抑制HIV的復(fù)制，同時(shí)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的聯(lián)用也對(duì)HIV的復(fù)制造成多重的障礙。CD19廣泛表達(dá)于大多數(shù)B淋巴細(xì)胞，是B淋巴細(xì)胞受體識(shí)別抗原中關(guān)鍵的信號(hào)傳遞分子，也是B淋巴細(xì)胞表面的特異性標(biāo)志，是參與B淋巴細(xì)胞活化、增殖、分化及抗體產(chǎn)生的重要膜抗原。目前，探討外周血CD19+B淋巴細(xì)胞的免疫活化和耗竭與HIV-1感染進(jìn)程相關(guān)性的研究較少。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD19+B淋巴細(xì)胞活化指標(biāo)CD38、耗竭指標(biāo)CD95和程序性死亡受體1(programmed cell death 1，PD-1)的表達(dá)情況，分析在HIV-1感染過(guò)程中CD19+B淋巴細(xì)胞的活化和耗竭情況，探討ART對(duì)HIV-1感染者CD19+B淋巴細(xì)胞水平及其CD38、CD95和PD-1水平的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2016～2018年在廣西疾病預(yù)防控制中心就診的101例HIV-1感染者為研究對(duì)象，年齡7～86歲，中位年齡39歲，其中男性78例、女性23例。納入標(biāo)準(zhǔn)：感染至納入研究時(shí)間不超過(guò)10年，CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<350個(gè)/μL。排除合并HBV、HCV感染。根據(jù)是否進(jìn)行過(guò)ART，分為未治療組73例(無(wú)特殊病史，體檢顯示無(wú)其他異常)和治療組28例。未治療組中男性61例、女性12例，年齡(37.45±15.65)歲；治療組中男性17例、女性11例，年齡(33.39±15.38)歲。另設(shè)健康對(duì)照組30例，納入標(biāo)準(zhǔn)：HIV-1陰性，身體健康，無(wú)疾病史、過(guò)敏史及免疫治療史。排除合并HBV、HCV感染。其中男性12例、女性18例，年齡12～80(31.43±12.40)歲。3組研究對(duì)象的年齡和性別構(gòu)成等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究獲得廣西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要儀器和試劑 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司(型號(hào)：CytoFLEX)，臺(tái)式水平離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司(型號(hào)：AG5453)。人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自Solarbio公司(生產(chǎn)批號(hào)：P8610)，RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Solarbio公司(生產(chǎn)批號(hào)：11875)，磷酸緩沖鹽溶液購(gòu)自Solarbio公司(生產(chǎn)批號(hào)：1020)，流式抗體Anti-Human CD19 APC-Cy7(生產(chǎn)批號(hào)：557791)，Anti-Human CD38-PerCP-Cy5.5(生產(chǎn)批號(hào)：551400)、Anti-Human CD95 PE-Cy7(生產(chǎn)批號(hào)：555674)、Anti-Human PD-1 APC(生產(chǎn)批號(hào)：558694)均購(gòu)自美國(guó)BD公司，4%多聚甲醛購(gòu)自BioSharp公司(生產(chǎn)批號(hào)：BL539A)。

1.3 檢測(cè)方法 于清晨抽取納入對(duì)象空腹?fàn)顟B(tài)下的外周靜脈血10 mL，存放于EDTA管中，再用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD19、CD38、PD-1、CD95的表達(dá)水平：每個(gè)樣本取50 μL PBMC懸液，加入1 μL的相對(duì)應(yīng)熒光素標(biāo)記的抗人單克隆抗體，即Anti-Human CD19 APC-Cy7、Anti-Human CD38-PerCP-Cy5.5、Anti-Human CD95 PE-Cy7、Anti-Human PD-1 APC，在4℃條件下避光孵育30 min，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次并棄去上清后，再用500 μL的1%多聚甲醛固定重懸，最后用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。本研究以CD19+B淋巴細(xì)胞作為細(xì)胞群，以熒光扣除對(duì)照作為設(shè)門(mén)依據(jù)，分析CD19+B淋巴細(xì)胞群上CD38、PD-1、CD95的表達(dá)水平。

1.4 設(shè)門(mén)策略 通過(guò)調(diào)整前向角散光(forward scatter,FSC)和側(cè)向角散射光(side scatter，SSC)選取PBMC，從選定的細(xì)胞群中根據(jù)所標(biāo)記熒光設(shè)門(mén)CD19+B淋巴細(xì)胞，再?gòu)腃D19+B淋巴細(xì)胞中設(shè)門(mén)觀察CD38、CD95、PD-1的表達(dá)情況，見(jiàn)圖1。

圖1 人PBMC設(shè)門(mén)策略

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以[M(P25,P75)]表示，比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。繪制散點(diǎn)圖并采用相關(guān)分析法分析CD19+B淋巴細(xì)胞水平以及CD95、CD38、PD-1表達(dá)量之間的關(guān)系。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組CD19+B淋巴細(xì)胞水平的比較 未治療組、治療組、健康對(duì)照組CD19+B淋巴細(xì)胞水平依次升高(均P<0.05)，見(jiàn)表1和圖2。

表1 3組CD19+B淋巴細(xì)胞水平的比較[M(P25，P75)，%]

圖2 各組CD19+B淋巴細(xì)胞水平檢測(cè)結(jié)果

2.2 3組CD19+B淋巴細(xì)胞CD38表達(dá)水平的比較 健康對(duì)照組和治療組CD19+B淋巴細(xì)胞CD38的表達(dá)水平均低于未治療組(均P<0.05)，而治療組和健康對(duì)照組CD19+B淋巴細(xì)胞CD38的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2和圖3。

表2 3組CD19+B淋巴細(xì)胞CD38表達(dá)水平的比較[M(P25，P75)，%]

圖3 各組CD19+B淋巴細(xì)胞CD95的表達(dá)情況

2.3 3組CD19+B淋巴細(xì)胞CD95表達(dá)水平的比較 未治療組、治療組、健康對(duì)照組CD19+B淋巴細(xì)胞CD95的表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)。見(jiàn)表3和圖4。

表3 3組CD19+B淋巴細(xì)胞CD95表達(dá)水平的比較(x±s，%)

圖4 各組CD19+B淋巴細(xì)胞CD95的表達(dá)情況

2.4 3組CD19+B淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)水平的比較 未治療組和治療組CD19+B淋巴細(xì)胞PD-1的表達(dá)水平均高于健康對(duì)照組(均P<0.05)，而治療組與未治療組CD19+B淋巴細(xì)胞PD-1的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4和圖5。

表4 3組CD19+B淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)水平的比較[M(P25，P75)，%]

圖5 各組CD19+B淋巴細(xì)胞PD-1的表達(dá)情況

2.5 未治療組CD19+B淋巴細(xì)胞水平、CD95、CD38、PD-1表達(dá)水平之間的相關(guān)性 相關(guān)分析結(jié)果顯示，未治療組HIV-1感染者外周血CD19+B淋巴細(xì)胞水平與CD38的表達(dá)水平、CD95的表達(dá)水平、PD-1的表達(dá)水平均不相關(guān)(均P>0.05)；CD38的表達(dá)水平與CD95的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)，而與PD-1的表達(dá)水平不相關(guān)(P>0.05)；CD95的表達(dá)水平與PD-1的表達(dá)水平間也無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 未治療組中CD19+B淋巴細(xì)胞水平以及CD38、CD95、PD-1表達(dá)水平之間的相關(guān)性

2.6 治療組外周血CD19+B淋巴細(xì)胞水平、CD95、CD38、PD-1 表達(dá)水平的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，治療組HIV-1患者外周血CD19+B淋巴細(xì)胞水平以及CD38、CD95、PD-1的表達(dá)水平，兩兩之間均不相關(guān)(均P>0.05)。見(jiàn)圖7。

圖7 治療組中CD19+B淋巴細(xì)胞水平以及CD38、CD95、PD-1表達(dá)水平之間的相關(guān)性

3 討 論

HIV-1感染會(huì)導(dǎo)致機(jī)體淋巴細(xì)胞異常，如CD4+T淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等。CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量隨著感染的進(jìn)展持續(xù)性減少，常作為HIV感染的臨床分期依據(jù)[6-7]。本研究中未治療組、治療組、健康對(duì)照組CD19+B淋巴細(xì)胞的百分比依次升高(均P<0.05)。這提示ART可能影響HIV-1感染者外周血中CD19+B淋巴細(xì)胞的表達(dá)。隨著HIV-1感染的進(jìn)展，CD19+B淋巴細(xì)胞的表達(dá)可能是動(dòng)態(tài)變化的，細(xì)胞的活化與耗竭可能是并存的。為進(jìn)一步探究CD19+B淋巴細(xì)胞活化與耗竭的變化規(guī)律，我們選取CD38、CD95、PD-1這幾個(gè)指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

CD38存在于B淋巴細(xì)胞表面，與B淋巴細(xì)胞的活化相關(guān)，CD38與B淋巴細(xì)胞受體以及CD19/CD21/CD81共受體等組成共刺激復(fù)合物，在復(fù)合物的刺激下B淋巴細(xì)胞的活化閾值降低，此外，CD38可激活磷脂酰肌醇激酶途徑，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的發(fā)育[8-9]。HIV-1感染可導(dǎo)致CD38表達(dá)升高，CD38的表達(dá)與體內(nèi)HIV-1的載量呈正相關(guān)，因此CD38可間接反映體內(nèi)的HIV-1載量[10]。本研究結(jié)果顯示，未治療組的CD19+B淋巴細(xì)胞的CD38表達(dá)水平高于治療組和健康對(duì)照組(均P<0.05)，提示，在HIV-1感染進(jìn)程中CD19+B淋巴細(xì)胞水平降低，導(dǎo)致CD19+B淋巴細(xì)胞的活化閾值降低，CD38隨之表達(dá)并促進(jìn)CD19+B淋巴細(xì)胞的成熟、修復(fù)。而治療組與健康對(duì)照組CD19+B淋巴細(xì)胞的CD38表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示ART可能作用于CD38，活化CD19+B淋巴細(xì)胞，從而彌補(bǔ)HIV-1感染造成的B淋巴細(xì)胞受損。

CD95主要存在于活化的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞表面，可通過(guò)依賴(lài)胱天蛋白酶通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。研究顯示，未經(jīng)治療的HIV-1感染者的B淋巴細(xì)胞中CD95的表達(dá)增加，這可能導(dǎo)致細(xì)胞的加速更新以及細(xì)胞對(duì)病原體、疫苗抗原的記憶喪失[12-14]。本研究中，未治療組、治療組、健康對(duì)照組CD19+B淋巴細(xì)胞CD95的表達(dá)水平依次降低(P<0.05)，即經(jīng)ART后HIV感染者的CD95表達(dá)水平雖較未治療組低，但仍高于健康對(duì)照組，不能完全恢復(fù)到健康人的狀態(tài)。這提示ART部分作用于CD95，而CD95能介導(dǎo)凋亡，誘導(dǎo)CD19+B淋巴細(xì)胞凋亡，間接抑制了體液免疫[15]。

PD-1參與HIV-1的感染進(jìn)程，在T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等細(xì)胞中均有表達(dá)，它能通過(guò)抑制機(jī)體的免疫功能，促進(jìn)疾病發(fā)展[16-19]。相關(guān)研究表明，HIV-1患者外周血中可溶性PD-1含量高于健康對(duì)照組，且與病毒載量呈正相關(guān)，與CD4淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)[20]；在HIV-1感染進(jìn)程中，CD8+T淋巴細(xì)胞中PD-1表達(dá)水平影響CD8+T淋巴細(xì)胞的活化及功能[21]。在本研究中，治療組、未治療組CD19+B淋巴細(xì)胞的PD-1表達(dá)水平均高于健康對(duì)照組(均P<0.05)，但治療組與未治療組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這提示ART可能不作用于PD-1。

我們?yōu)檫M(jìn)一步分析CD19+B淋巴細(xì)胞耗竭與活化之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，治療組外周血CD19+B淋巴細(xì)胞水平及CD19+B淋巴細(xì)胞上的CD38、PD-1、CD95的表達(dá)水平之間均不相關(guān)(均P>0.05)；在未治療組中僅有CD38與CD95的表達(dá)水平之間呈正相關(guān)(P<0.05)，而其他指標(biāo)之間均不存在相關(guān)性(均P>0.05)。這提示在HIV-1感染者中CD19+B淋巴細(xì)胞的活化與耗竭間存在正相關(guān)關(guān)系，且ART可能影響CD38與CD95之間的互作用。

綜上所述，ART可能通過(guò)影響HIV-1感染者CD19+B淋巴細(xì)胞中CD38與CD95的表達(dá)及二者之間的相互作用，對(duì)HIV-1感染者的體液免疫功能發(fā)揮一定的修復(fù)作用。ART可能不影響HIV-1感染者CD19+B淋巴細(xì)胞中PD-1的表達(dá)水平。ART增強(qiáng)CD19+B淋巴細(xì)胞活化并抑制其凋亡的作用，或可成為今后抗HIV-1感染的一個(gè)新思路。