趙艷艷 王廷春 李小川 張樞 袁小青 段小群

【摘要】目的在二硫蘇糖醇和抗壞血酸兩種不同抗氧化劑條件下，建立測定卡托普利血漿濃度的液相色譜-串聯(lián)質譜法（LC-MS/MS），經(jīng)方法學驗證后將兩種方法分別應用于臨床樣本檢測中，系統(tǒng)的對比分析兩種抗氧化劑對卡托普利濃度檢測的影響，為卡托普利的臨床研究提供科學依據(jù)。方法：在不同抗氧化劑條件下考察卡托普利的穩(wěn)定性，添加了抗氧化劑的卡托普利血漿樣本，經(jīng)2，4-二溴苯乙酮衍生化后，乙腈沉淀蛋白處理，ZORBAX SB-C184.6*150mm，3.5μm色譜柱洗脫分離，采用電噴霧離子源多反應監(jiān)測模式下的正電離法分析檢測，建立卡托普利LC-MS/MS方法，并在此基礎上分別進行方法學驗證，最后將兩種方法應用于卡托普利臨床生物樣本分析中。結果：卡托普利血漿樣本在10～2000ng/mL（二硫蘇糖醇）和2～1000ng/mL（抗壞血酸）（r均≥0.9994）范圍內線性關系良好，批內精密度≤7.4%（n=6），批間精密度≤14.4%（n=18），準確度為94.7～108.3%，提取回收率為86.6～108.4%（n=6），基質效應的RSD為1.1%～3.5%（n=6）。穩(wěn)定性（凍融循環(huán)、長期、短期、冰浴避光）實驗中卡托普利的偏差均小于±15%（n=3）。二硫蘇糖醇和抗壞血酸條件下卡托普利的AUC0～t分別為（3474.8±741.4）、（380.1±108.9）ng﹒h/mL，AUC0～∞分別為（3725.2±798.9）、（389.0±110.1）ng·h/mL ，Tmax分別為（0.94±0.36）、（0.72±0.17）h，Cmax分別為（877.7±182.8）、（319.8±119.7）ng /mL。結論：0.5%4 mol/L二硫蘇糖醇和0.2%4 mol/L抗壞血酸水溶液均可使卡托普利穩(wěn)定利于檢測。兩種抗氧化劑條件下卡托普利方法學驗證結果均符合生物分析要求，兩種檢測方法都可應用于卡托普利臨床樣本分析，但兩種方法的卡托普利藥代動力學參數(shù)有差異性，臨床研究可根據(jù)實驗需求進行選擇。

【關鍵詞】抗氧化劑 ;卡托普利;液相色譜-串聯(lián)質譜法

卡托普利是一種血管緊張素轉換酶的特異性競爭性抑制劑，廣泛應用于高血壓和充血性心力衰竭的治療，它在血漿中消除半衰期相對較短，口服生物利用度較低（60-75%），與其它高血壓藥物相比副作用較小?？ㄍ衅绽Y構中有個活性較高的巰基基團，在生物基質中，硫醇類化合物很容易被氧化成二硫化物或與內源性硫醇結合形成二聚體。由于其活性巰基的存在，很難直接測定人體血漿中的卡托普利，為卡托普利的生物分析帶來極大的困擾。

在測量卡托普利血漿濃度前，需先添加抗氧化劑保護卡托普利不被氧化，以防止二硫化物的形成?？箟难幔╒itamin C， VC）由于其特殊的結構，在各種化學反應中發(fā)揮抗氧化劑的作用。通過抗氧化劑自身氧化，使得空氣中的氧與抗氧化劑先結合，消耗卡托普利內部與周圍環(huán)境的氧，從而防止卡托普利被氧化。二硫蘇糖醇（Dithiothreitol， DTT） 是一種常用的巰基保護劑，通過硫醇-二硫鍵交換反應還原分子內或分子間二硫鍵，可以將轉化的二硫二聚體（或共軛物）還原為卡托普利。卡托普利本身的靈敏性低和性能差，不適用于生物醫(yī)學分析，但適當?shù)难苌梢酝ㄟ^LC-MS/MS分析方法進行測量。目前并沒有任何研究將兩種不同的抗氧化劑進行系統(tǒng)的比較并分析這兩種抗氧化劑對卡托普利臨床樣本檢測的影響。

本文在VC和DTT兩種抗氧化劑條件下分別建立了測定人血漿中卡托普利的LC-MS/MS方法，在此基礎上對這兩種方法進行了驗證，最后成功應用于卡托普利臨床樣本分析。經(jīng)過不同方法檢測得出的卡托普利濃度體現(xiàn)了較大的差異性，該數(shù)據(jù)能夠有助于判斷實際臨床試驗過程中卡托普利抗氧化劑的選擇。

1材料

1.1儀器

液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司，包括DGU-20A3R脫氣機，LC-20AD液相泵，SIL-20AC自動進樣器，CTO 20S柱溫箱）;三重四極桿串聯(lián)API4000質譜儀（配備電噴霧離子源（ESI源）和Analyst 1.6.2數(shù)據(jù)處理軟件（美國AB Sciex公司）;醫(yī)用離心機（3k15，德國Sigma公司）;天平（Secura 225D-1CN，德國Sartorius公司）;渦旋混合儀（Vortex-Genie2，美國Scientific公司）。1.2藥品與試劑

卡托普利（中國食品藥品檢定研究院，批號：100318-201904，純度：99.7%）卡托普利-d3（中國食品藥品檢定研究院，批號：20-JHY-124-3，化學純度：95%;同位素純度：98.3%）;抗壞血酸（Aladdin，批號：L1920112，純度：99.99%）;二硫蘇糖醇（Aladdin，批號：P1378642，，純度：98%）;2，4-二溴苯乙酮（Aladdin，批號：L1522183，純度：99%）;卡托普利片（美國Bristol-Myers Squibb公司，規(guī)格25 mg/片）。

2 方法和結果

2.1不同抗氧化劑前處理方法開發(fā)

2.1.1 DTT對卡托普利生物樣品穩(wěn)定性的影響將4 mol/L的DTT水溶液按照5%的比例加入血漿樣本中，考察卡托普利血漿樣本在冰浴避光0.5 、1 、2 h的穩(wěn)定性，見表1。結果表明卡托普利血漿樣品中加入0.5%4mol/L DTT水溶液后，卡托普利氧化被抑制，RE在-6.8%～-3.0%之間，其血漿樣品在0.5、1、2h無明顯變化，穩(wěn)定性較好。

2.1.2DTT對卡托普利穩(wěn)定性的影響通過不加DTT放置0.5h、1 h后與再加入DTT經(jīng)前處理后進樣對比分析卡托普利血漿樣本的穩(wěn)定性，見表2。結果表明卡托普利血漿樣品在室溫避光條件下，降解明顯，在降解后的樣品中加入0.5%4mol/LDTT水溶液后，DTT對降解產(chǎn)物進行了還原，使得穩(wěn)定性樣品與即刻樣品的RE在-10.0%～-4.0%之間。

2.1.3VC對卡托普利生物樣品穩(wěn)定性的影響將3 mol/L、4 mol/L的VC水溶液按照2%的比例加入卡托普利血漿樣本中，經(jīng)前處理后考察卡托普利血漿樣本在1 h、4 h的穩(wěn)定性，見表3。結果表明在冰浴避光條件下，含0.2%4 mol/LVC水溶液的卡托普利血漿樣品更穩(wěn)定。

2.2溶液的制備

2.2.1 ?標準曲線、質控樣品工作溶液的制備精密稱取卡托普利標準品2份，用甲醇溶液配制成1 mg/ml的卡托普利儲備液，1份用于標準曲線工作溶液的的配制，1份用于質控工作溶液的配制。取卡托普利的儲備液以50%甲醇水進行稀釋，獲得卡托普利標準曲線及質控的工作溶液。精密稱取對照品卡托普利-d3，用甲醇溶液配制成卡托普利內標儲備液并用乙腈溶液配制成內標工作溶液。

2.2.2DTT條件下卡托普利標準曲線、質控血漿樣品的制備取標準曲線、質控工作液10μL加入190μL的混合空白血漿（含0.5% 4 mol/L的DTT水溶液），混勻配制成卡托普利質量濃度分別為10.0、25.0、50.0、100、200、500、1000、2000ng/mL標準曲線系列樣品和質量濃度分別為10.0 、20.0 、160 、1600ng/mL 的質控樣品。

2.2.3 ?VC條件下卡托普利標準曲線、質控血漿樣品的制備取標準曲線、質控工作液10μL加入190μL的混合空白血漿（含2%4 mol/L的VC水溶液），混勻配制成卡托普利質量濃度分別為2.00、5.00、10.0、50.0、100、200、500 1000 ng/mL的標準曲線系列樣品和質量濃度分別為2.00、4.00 、300 、800 ng/mL 的質控樣品。

2.2.4 ?血漿樣本的處理取200μL血漿樣本加入10μL內標工作溶液及40μL 2，4-二溴苯乙酮渦旋混勻1min，室溫條件下衍生30min，加入1000μL乙腈，渦旋混勻1min，15400g條件下離心10min，取200μL進樣分析。

2.3色譜條件與質譜條件

2.3.1 ?色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6*150mm，3.5μm，Agilent）;預柱：Accucore XL C18（2.1*10mm，4μm，Thermo）;流動相：水溶液（含0.1%甲酸和5mmol/L乙酸銨）-乙腈溶液;梯度洗脫（（0.01min～0.20min，30-80%B;0.02min～2.00min，80%B;2.00min～2.01min，80-30%B;2.01min～4.00min，30%B）;流速：1ml/min;柱溫40.0℃;自動進樣器溫度為4℃;進樣體積為2μL。

2.3.2 ?質譜條件 帶有ESI源的API4000質譜，以正離子模式，采用多反應監(jiān)測（MRM）掃描模式。噴霧電壓：5.5kV;噴霧器溫度：500℃;霧化氣：50psi;加熱輔助氣：50psi;氣簾氣：20psi;碰撞氣：8psi;掃描時間：200ms?？ㄍ衅绽?jīng)衍生劑2，4-二溴苯乙酮衍生化后含有堿性氮原子，易在ESI源正離子檢測模式下產(chǎn)生較高響應，卡托普利衍生化物定量分析質荷比（m/z）414.1→216.0， 卡托普利-d3內標離子對衍生化物定量分析質荷比（m/z）m/z417.1→219.0。

2.4專屬性考察

2.4.1 DTT條件下卡托普利的專屬性考察六個不同來源的單個空白基質未出現(xiàn)顯著干擾，待測物與內標互不干擾，結果見圖1。

2.4.2 VC條件下卡托普利的專屬性考察六個不同來源的單個空白基質未出現(xiàn)顯著干擾，待測物與內標互不干擾，結果見圖2。

2.5標準曲線和定量下限

分別取“2.2.2”和“2.2.3”項下標準曲線樣品和質控樣品，按照“2.2.4”項下方法處理后，進樣分析。DTT條件下得到的典型標準曲線為y=0.00455x-0.000773（r=0.9999），卡托普利血藥濃度在20～2000 ng/mL范圍內線性關系良好，其定量下限為20 ng/mL。VC條件下得到典型標準曲線為y=0.00342x+0.000629（r=0.9999）;卡托普利血藥濃度在2～1000 ng/mL范圍內線性關系良好，其定量下限為2ng/mL。

2.6 ?準確度與精密度考察不同條件下卡托普利的準確度與精密度考察 取“2.2.2”和 “2.2.3”項下質控樣品，按照“2.2.4”項下方法處理后，進樣分析，測定3個分析批，每批每個濃度做6個平行樣品進樣分析?？疾炱渑鷥燃芭g的準確度和精密度，結果見表4和表5。

2.7 ?提取回收率和基質效應考察6批不同來源的空白血漿分別加入VC和DTT兩種抗氧化劑經(jīng)預處理后得到上清液加入質控工作溶液配制成基質效應樣品，與相同濃度的純溶液樣品所測得的峰面積比值進行比較，考察其基質效應。提取回收率考察3個質控濃度樣品與空白血漿樣品預處理后再加入適當工作液配的同濃度樣品所測得的峰面積比值。不同條件下卡托普利的基質效應和提取回收率分析物提取回收率在86.6%～108.4%之間，基質效應在93.4%～108.3%之間，CV均≤4.3%;，符合生物樣品分析要求，見表6和表7。

2.8穩(wěn)定性考察 ?不同條件下卡托普利的穩(wěn)定性考察按“2.6.1”項下方法配制低、高質量濃度的卡托普利質控樣品，每個濃度平行3份，考察血漿樣品中卡托普利在冰浴避光條件下短期、-25 ℃避光放置7天、-80 ℃避光放置28天、60天、5次反復凍融、處理后樣品自動進樣器4 ℃放置48 h的穩(wěn)定性，以上條件下穩(wěn)定性均良好，結果見表8和表9。

2.9藥動學實驗

受試者給藥前一天晚上禁食不禁水10小時以上，給藥當天空腹口服一片卡托普利片（25 mg），給藥前后lh內禁止飲水。給藥前和給藥后15min、30min、45min、l.00 h、l.25h、l.50h、l.75h、 2.00h、 2.50h、3.00h、4.00h、5.00h、6.00h、8.00h、10.00h、12.00h、24.00h共18個采血點，每個采血點采4 mL，4000 r/min離心5 min，分離血漿分別置于提前加好不同抗氧化劑的凍存管中，-80 ℃保存，后取血漿樣品按“2.2.4”項下方法處理后，進樣分析，采用Phnenix WinNonlin 7.0軟件以非房室模型計算臨床受試者體內卡托普利的Cmax，AUC0-t，AUC0-∞，Tmax，t1/2，λz，AUC_%Extrap等主要藥動學參數(shù)，藥動學參數(shù)結果見表10，平均藥時曲線圖見圖3和圖4。

3討論

為了考察兩種不同抗氧化劑對卡托普利生物樣品檢測的影響，本研究建立了DTT和VC兩種不同條件下生物樣品中卡托普利的LC-MS/MS分析方法，并對這兩種方法進行了驗證，均符合生物分析要求，這兩種分析方法均可用于卡托普利臨床樣本檢測，通過不同方法對臨床樣本進行檢測，所得結果體現(xiàn)了差異性。

將DTT和VC兩種抗氧化劑條件下的LC-MS/MS分析方法應用到臨床樣本檢測時，我們發(fā)現(xiàn)DTT條件下卡托普利血藥濃度明顯比VC條件下的卡托普利血藥濃度高，因為DTT將卡托普利二硫化物還原為卡托普利，實際檢測的濃度為卡托普利和卡托普利二硫化物的總濃度，因此DTT條件下卡托普利血藥濃度偏高。DTT條件下卡托普利達峰時間較晚，半衰期較長。

本研究建立的兩卡托普利檢測種方法簡單、易于操作，靈敏度高，得出了不同抗氧化劑條件下卡托普利樣本濃度及藥代動力學的差異性。此項研究為卡托普利臨床研究抗氧化劑的選擇和卡托普利檢測提供了數(shù)據(jù)支持和參考依據(jù)。

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