陳 強(qiáng)， 梁哲勇， 屈航英， 鐘 亮， 郜 揚(yáng)， 郝軍軍， 馬 濤， 韓 丹

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心血管外科，陜西 西安 710061

大蒜為百合科植物，其鱗莖用于防治疾病已有悠久歷史[1]。近年來，有關(guān)大蒜的化學(xué)藥理研究得到了廣泛的重視，并且取得了突破性的進(jìn)展[1-2]。大蒜素化學(xué)名為二烯丙基三硫化物，分子式為C6H10S3，相對分子量為178.3，是大蒜內(nèi)的蒜氨酸在蒜酶的作用下酶解形成的活性成分[3]。多項研究表明，大蒜素具有抗氧化、抗病原微生物、抗炎、清除自由基、抗腫瘤細(xì)胞增生、調(diào)控細(xì)胞凋亡、降低膽固醇、抗血栓形成等作用[4-6]。深Ⅱ度燙傷是臨床上較為常見的一種燙傷類型，累及真皮乳頭層以下，但仍殘留部分網(wǎng)狀層，深淺不一，易發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，且易合并感染。有研究證實，燒燙傷導(dǎo)致皮膚發(fā)生炎癥及代謝異常的機(jī)制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)[7]。本研究采用SD大鼠深Ⅱ度燙傷模型探討大蒜素治療深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的作用及機(jī)制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠50只，體質(zhì)量(250±10)g，成年雄性，提供機(jī)構(gòu)為西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。取材前，所有大鼠飼養(yǎng)1周，正常飲食，自由飲水，環(huán)境12：12光暗循環(huán)，溫度18～25℃，濕度45%～65%，氨濃度<20 mg/L，換氣量1.27 m/h。

1.2 試劑及儀器 顯微鏡(日本OLYMPUS，CX31-12C04)；石蠟切片機(jī)(德國Leica，RM2235)；電熱水器；溫度計；量筒(200 ml)；HE染液；京萬紅燙傷膏(天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，Z12020440)；欣帝大蒜素注射液(濟(jì)南利民制藥有限責(zé)任公司，H20046064)；芝麻油；生理鹽水；白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6試劑盒、IL-10試劑盒、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒(上海生工生物)；β-actin抗體、PERK抗體、P-eIF2α抗體、CHOP抗體、Bax抗體、Caspase-12抗體、Bcl-2抗體、Cleaved Caspase-3抗體(美國CST)；BCA蛋白定量試劑盒(美國賽默飛)。

1.3 實驗方法

1.3.1 配制大蒜素油 以大蒜素注射液為母液，用無菌芝麻油分別將母液稀釋為10%、5%、1%的濃度。

1.3.2 燙傷模型制作 將50只SD大鼠隨機(jī)分為A、B、C、D、E組，每組各10只。各組大鼠造模前根據(jù)體質(zhì)量以0.3 ml/100 g腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液實施麻醉。待大鼠麻醉后，取硫化鈉溶液在大鼠背部脫毛，并用生理鹽水擦凈脫毛液。將盛90℃熱水的量筒底部置于大鼠背部15 s，面積接近10%總體表面積，構(gòu)建深Ⅱ度燙傷模型[8]。見圖1。燙傷模型構(gòu)建好后立即生理鹽水5 ml腹腔注射。大鼠醒后分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。A組涂抹芝麻油作為陰性對照組，B組涂抹京萬紅燙傷膏作為陽性對照組，C、D、E組分別涂抹10%、5%、1%大蒜素油。

圖1 大鼠深Ⅱ度燙傷模型制作

1.3.3 燙傷創(chuàng)面處理 燙傷6 h后對大鼠進(jìn)行給藥處理，在大鼠清醒條件下，對創(chuàng)面進(jìn)行雙氧水消毒，再根據(jù)分組分別將0.5 ml不同濃度大蒜素油、1.0 g京萬紅燙傷膏、0.5 ml芝麻油均勻涂抹在大鼠的燙傷創(chuàng)面上，給藥頻次為12 h 1次，連續(xù)給藥直至大鼠創(chuàng)面全部愈合。每天觀察燙傷創(chuàng)面具體愈合狀態(tài)，記錄潰破、滲出、感染情況，以全部上皮覆蓋作為創(chuàng)面愈合的標(biāo)志。

1.3.4 標(biāo)本取材及處理 燙傷后12 d，取創(chuàng)面組織標(biāo)本固定在4%甲醛溶液內(nèi)，石蠟包埋后切片，HE染色，光鏡下觀察組織學(xué)特征。

1.3.5 分子生物學(xué)檢測 燙傷創(chuàng)面MDA、SOD、CAT含量測定：取0.1 g燙傷創(chuàng)面組織加入生理鹽水制成10%組織勻漿，置離心管中以3 000 r/min離心15 min，取上清液，硫代巴比妥酸法測定MDA，黃嘌呤氧化酶法測定SOD，高錳酸鉀滴定法測定CAT。血清IL-6、IL-10、TNF-ɑ水平測定：將大鼠眼球血以3 000 r/min離心15 min，取上清液酶聯(lián)免疫法測定血清IL-6、IL-10、TNF-ɑ水平。

1.3.6 Western Blotting檢測 每1 ml蛋白裂解液RIPA中加入20 μl(50×)蛋白酶抑制劑儲存液，使抑制劑終濃度為1 mmol/L。取0.1 g燙傷創(chuàng)面組織加入上述蛋白裂解液制成組織勻漿，冰上孵育0.5 h，3次旋渦振蕩，4℃下12 000 r/min離心30 min(半徑為12 cm)，將上清液轉(zhuǎn)移至干凈EP管內(nèi)，BCA法檢測各組樣本中的蛋白質(zhì)濃度，分裝后置于-80℃冰箱保存。取40 g蛋白樣品進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，50 g/L牛血清白蛋白TBST緩沖液室溫封閉硝酸纖維膜，再加入不同的一抗孵育4℃過夜。TBST緩沖液3次洗滌后加入二抗孵育1 h，TBST緩沖液3次洗滌膜后加入ECL發(fā)光液，曝光，成像。軟件檢測各條帶灰度值，結(jié)果用目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠創(chuàng)面愈合情況比較 用藥后12 h，C、D組創(chuàng)面淤血呈斑塊狀散開，其他組創(chuàng)面淤血仍為片狀。3 d內(nèi)，各組創(chuàng)面均紅潤；3 d后，D組創(chuàng)面水腫、淤血大多消失不見。隨著給藥時間延長，C、D組肉芽組織明顯生長，創(chuàng)面縮小顯著。B、C、D、E組創(chuàng)面均未出現(xiàn)感染；A組創(chuàng)面部分出現(xiàn)紅腫，創(chuàng)面痂下有積膿出現(xiàn)。7～11 d，B、C、D、E組創(chuàng)面痂皮出現(xiàn)大量脫落，創(chuàng)面逐漸與皮面平整，基本填充了肉芽組織；而A組創(chuàng)面痂皮僅出現(xiàn)部分脫落，創(chuàng)面低于皮面，可以發(fā)現(xiàn)薄層肉芽。12 d時，B、C、D、E組創(chuàng)面大部分已愈合，而A組創(chuàng)面愈合時間出現(xiàn)了一定程度的延遲。5組中，D組創(chuàng)面愈合時間最短(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠燙傷創(chuàng)面愈合時間比較

2.2 各組大鼠創(chuàng)面病理切片結(jié)果比較 傷后12 d取創(chuàng)面組織標(biāo)本制作病理切片光鏡下觀察。C、D、E組鏡下可見上皮明顯增生且較為完整，已近似于正常鱗狀上皮，真皮淺層部位可發(fā)現(xiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤，存在輕微炎癥反應(yīng)，殘存毛囊可見再生修復(fù)。A組可見上皮增生不明顯且不完整，表面可見滲出物形成的結(jié)痂，部分表皮壞死層附著，炎癥細(xì)胞開始減退，部分創(chuàng)面出現(xiàn)感染，大量炎癥細(xì)胞浸潤，炎癥反應(yīng)明顯，創(chuàng)面出現(xiàn)一定程度的加深，可累及至真皮的深層殘存附件。B組上皮增生明顯但不完整，可見增生的上皮呈舌狀，上皮細(xì)胞輕度水腫，真皮淺層發(fā)現(xiàn)浸潤大量炎癥細(xì)胞，炎癥反應(yīng)較為明顯。見圖3。

圖3 各組大鼠創(chuàng)面病理切片(a.A組；b.B組；c.D組)

2.3 各組大鼠創(chuàng)面組織MDA、SOD、CAT水平比較 D組MDA水平低于A組和B組，B組低于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。D組SOD、CAT水平高于A組和B組，B組高于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠創(chuàng)面組織MDA、SOD、CAT水平比較

2.4 各組大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平比較 D組IL-6、TNF-ɑ水平低于A組和B組，B組低于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。D組IL-10水平高于A組和B組，B組高于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平比較

2.5 各組大鼠創(chuàng)面組織蛋白表達(dá)程度比較 與A、B組比較，D組PERK、P-eIF2α、CHOP蛋白表達(dá)程度顯著降低(P<0.05)。見圖4。與A、B組比較，D組Bax蛋白表達(dá)程度顯著降低，Bax/Bcl-2下降(P<0.05)。見圖5。與A、B組比較，D組Caspase-12、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)程度顯著降低(P<0.05)。見圖6。

圖4 各組大鼠創(chuàng)面組織PERK、P-eIF2α、CHOP蛋白表達(dá)

圖5 各組大鼠創(chuàng)面組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

圖6 各組大鼠創(chuàng)面組織Caspase-12、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)

3 討論

制作動物皮膚燙傷模型的方法很多，激光、恒溫恒壓電燙儀、手提壓力蒸汽消毒器等可通過精確控制溫度、壓力、時間及燙傷面積獲得恒定的、有重復(fù)性的燙傷模型，但方法較為復(fù)雜，成本高，使用不方便。本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]，找到了一種利用量筒、溫度計、電熱水器制作的可控溫度、壓力及面積的大鼠燙傷裝置，其不僅能夠達(dá)到獲得不同深度燙傷模型的要求，還具有簡單、經(jīng)濟(jì)、使用方便、重復(fù)性好等優(yōu)點。

燒燙傷創(chuàng)面的主要致病菌為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌，且耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重[9]。大蒜素是一類廣譜抗菌藥，能夠抑制和殺死大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，以及包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌在內(nèi)的多種耐藥菌[10-12]。但大蒜素對皮膚有較強(qiáng)的刺激作用，高濃度大蒜素直接用于創(chuàng)面會引起劇烈疼痛，用芝麻油稀釋大蒜素可降低大蒜素的不穩(wěn)定性，減輕臭味和對皮膚的刺痛腐蝕作用，同時增加大蒜素的皮膚滲透性。因此，本研究將大蒜素溶于芝麻油，制成不同濃度的大蒜素油。本研究結(jié)果顯示：5組大鼠中，D組創(chuàng)面愈合時間最短(P<0.05)；C、D、E組傷后12 d病理切片光鏡下可見創(chuàng)面無感染，炎癥反應(yīng)輕。即接受5%大蒜素油處理大鼠的創(chuàng)傷愈合時間最短，效果最好。10%大蒜素油效果不及5%的原因可能為高濃度大蒜素對新生肉芽組織具有一定的刺激性。

大蒜素對燙傷創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用可能與其抗炎作用、抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。在動物實驗中，大蒜素可抑制二甲苯性小鼠耳廓腫脹和大鼠蛋清性足腫脹的急性滲出性炎癥[13-14]。有研究表明，大蒜素能夠抑制TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶及其產(chǎn)物一氧化氮、核因子κB、粘附分子的表達(dá)，調(diào)節(jié)IL，發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用[15-17]。在炎癥的病理條件下，白細(xì)胞分泌大量超氧負(fù)離子，其通過自發(fā)歧化作用轉(zhuǎn)化為H2O2，大量的超氧負(fù)離子和H2O2可通過Fenton型Haber-Weiss反應(yīng)產(chǎn)生損傷作用更強(qiáng)的羥自由基，羥自由基會進(jìn)一步造成核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素具有抗氧化、清除自由基的作用，能夠?qū)ρ装Y引起的自由基損傷起到一定保護(hù)作用[18-21]。本研究結(jié)果顯示：D組IL-6、TNF-ɑ水平低于A組和B組，B組低于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；D組IL-10水平高于A組和B組，B組高于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。即5%大蒜素油可顯著減少燙傷大鼠血清中IL-6、TNF-α，增加IL-10，這提示，大蒜素對深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面具有抗炎作用。此外，燒燙傷創(chuàng)面發(fā)生不完全氧化會產(chǎn)生大量活性氧，抗氧化酶SOD、CAT過度消耗也會導(dǎo)致活性氧蓄積，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。SOD是活性氧在生物體內(nèi)的高效催化劑，SOD催化活性氧發(fā)生還原反應(yīng)生成H2O2，而CAT可以進(jìn)一步還原H2O2生成水和氧，因此，SOD、CAT對調(diào)節(jié)活性氧平衡至關(guān)重要[22]。MDA是活性氧氧化脂質(zhì)反應(yīng)的終產(chǎn)物，在一定程度上反映活性氧的代謝程度[23]。本研究中：D組MDA含量低于A組和B組，B組低于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；D組SOD、CAT含量高于A組和B組，B組高于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。即5%大蒜素油可顯著降低燙傷組織中MDA含量，提高SOD、CAT活性，這提示，5%大蒜素油對大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的氧化應(yīng)激具有抑制作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)、鈣離子平衡、脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)及保護(hù)細(xì)胞功能的重要病理生理過程[24]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的PERK分子是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)、維持線粒體正常生理功能及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的重要組成部分。病理狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK信號通路被激活，上調(diào)CHOP、Bax等表達(dá)，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)功能障礙，釋放活性氧等凋亡因子。過量的活性氧會活化促炎癥蛋白酶Caspase-1，使IL-1β、IL-6等炎癥因子異常增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡及炎癥性壞死[25]。有研究報道，燒燙傷可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，嚴(yán)重影響細(xì)胞及機(jī)體代謝，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能作為治療燒燙傷的重要靶點[7]。本研究結(jié)果顯示：與A、B組比較，D組PERK、P-eIF2α、CHOP、Bax、Caspase-12、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)程度顯著降低，Bax/Bcl-2下降(P<0.05)。這提示，大蒜素治療燙傷創(chuàng)面的機(jī)制可能是抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)PERK/P-eIF2α/CHOP通路。

綜上所述，大蒜素可減輕SD大鼠深Ⅱ度燙傷炎癥反應(yīng)，縮短創(chuàng)面愈合時間，其機(jī)制可能與大蒜素抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)PERK/P-eIF2α/CHOP通路有關(guān)。