許 琴,王 瑋,董 翔,李建瑛,是文輝,劉曉祿,劉愛(ài)中,馬 娜,宋來(lái)陽(yáng),劉江偉

(1.新疆軍區(qū)總醫(yī)院,新疆特殊環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊830000;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所,新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊830091;3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院,烏魯木齊830091)

耐輻射菌于1956年由美國(guó)科學(xué)家Anderson發(fā)現(xiàn)，該菌在5～15 kGy的γ射線(xiàn)照射下仍能存活（一般細(xì)菌在2～5 kGy的γ射線(xiàn)照射下即可完全滅活），將其命名為Micrococcusradiodurans［1］。后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該菌的生長(zhǎng)特性、生理生化特征及16 SrRNA明顯異于普通的微球菌，因此將其更名為耐輻射奇球菌（Deinococcus radiodurans，DR），在分類(lèi)學(xué)上屬于異常球菌綱（Deinococci）異常球菌目（Deinococcales）異常球菌科（Deinococcaceae）異常球菌屬（Deinococcus）［2］。該菌株革蘭染色呈陽(yáng)性，嚴(yán)格好氧生長(zhǎng)，不形成芽孢，無(wú)致病性，電子顯微鏡下觀察表明該菌常以四聚體存在，生長(zhǎng)需要豐富的氨基酸、糖類(lèi)和維生素B（或其類(lèi)似物），在TGY培養(yǎng)基（含0.5%胰蛋白胨、0.1%葡萄糖和0.3%酵母提取物）上形成紅色菌落。目前，DR已作為異常球菌屬的代表菌株被廣泛研究［3-4］。DR不但可以耐受15 kGy急性電離輻射和0.06 Gy/h慢性照射，并具有很強(qiáng)的抗干燥能力［5］。指數(shù)生長(zhǎng)期的DR對(duì)電離輻射、紫外線(xiàn)的抗性分別是大腸埃希菌的200倍和20倍，經(jīng)受20 kGy射線(xiàn)的電離輻射后，DR是測(cè)試中唯一存活的微生物［6］。研究表明，電離輻射輻照DR后，存活率和劑量關(guān)系為一個(gè)肩形曲線(xiàn)，在某一劑量點(diǎn)以前，存活率幾乎為100%，充分表明了其極強(qiáng)的輻射抗性［7］。據(jù)此推測(cè)，DR在生命科學(xué)研究中可能有廣闊的應(yīng)用前景。近年來(lái)，科研人員對(duì)該菌在重金屬及核污染環(huán)境修復(fù)、基因修復(fù)等方面研究較多，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及藥理學(xué)研究相對(duì)較少?，F(xiàn)有文獻(xiàn)未見(jiàn)DR活菌及其菌體破碎物相關(guān)的急性和慢性毒性實(shí)驗(yàn)報(bào)告。因此，本實(shí)驗(yàn)以DR的標(biāo)準(zhǔn)菌株R1為研究對(duì)象，探討該菌對(duì)大鼠的慢性毒性，以期為DR作為腸道益生菌的推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑儀器

SPF級(jí)SD大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心［SCXK（新）2016-0001］，飼養(yǎng)于屏障設(shè)施［SYXK（軍）2017-0050］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)新疆軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)［DWLL20190729］。DR標(biāo)準(zhǔn)菌株耐輻射奇球菌R1（Deinococcus radioduransR1，DRR1）由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院應(yīng)用微生物研究所提供，DRR1菌株的復(fù)壯及培養(yǎng)均在該單位的特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。全自動(dòng)生化分析儀（BS-180）、全自動(dòng)電解質(zhì)分析儀（IMS-972）和全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（BC-2800vet）均購(gòu)自中國(guó)深圳邁瑞公司；臺(tái)式低速離心機(jī)（TDZ5）購(gòu)自湖南赫西儀器裝備有限公司；超聲破碎儀（SK3310LHC）購(gòu)自上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.2 DRR1濃度確定及其細(xì)菌破碎物的制備

DRR1菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，測(cè)定其吸光度值；吸光度值達(dá)到1.9～2.0，細(xì)菌增殖基本停止，根據(jù)其生長(zhǎng)曲線(xiàn)，此時(shí)的DRR1菌液濃度為109/mL，即為高濃度活菌菌液。高濃度DRR1菌液用TGY瓊脂培養(yǎng)液（含0.5%胰蛋白胨、0.1%葡萄糖和0.3%酵母提取物）稀釋至107/mL，作為低濃度活菌菌液。分別將高、低濃度的活菌液于－80℃冰箱及超聲破碎儀中（37℃，50 kHz，30 min）反復(fù)凍融和超聲破碎5～7次，得到高、低濃度的DRR1菌體破碎物。新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室每次為本實(shí)驗(yàn)提供5 d用量的新鮮高濃度DRR1菌液，共6批次。每批次菌液經(jīng)上述處理后得到4組受試樣品，按日需求量進(jìn)行無(wú)菌分裝及標(biāo)記，然后置于4℃醫(yī)用冰箱內(nèi)保存，每日按需進(jìn)行灌胃給藥。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

80只大鼠隨機(jī)分為5組，DRR1高濃度（109/mL）組（簡(jiǎn)稱(chēng)LDRH組）、DRR1低濃度（107/mL）組（簡(jiǎn)稱(chēng)LDRL組）、DRR1破碎物高濃度（109/mL）組（簡(jiǎn)稱(chēng)BDRH組）、DRR1破碎物低濃度（107/mL）組（簡(jiǎn)稱(chēng)BDRL組）和對(duì)照組（即TGY組），每組16只，雌雄各半。各組動(dòng)物按1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥30 d，末次給藥后2 h，稱(chēng)重。每組隨機(jī)取8只大鼠，以0.15 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液，深度麻醉大鼠，留取抗凝靜脈血及生化檢測(cè)靜脈血，進(jìn)行血常規(guī)、血清電解質(zhì)及血清生化指標(biāo)檢測(cè)，并留取各主要臟器，稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算臟器系數(shù)。心臟、肝臟、腎和肺組織經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%的中性甲醛溶液固定，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其病理改變。剩余8只大鼠停止給藥后正常飼養(yǎng)2周（恢復(fù)期），按上述方法留取標(biāo)本，同法檢測(cè)。

1.4 觀測(cè)指標(biāo)

給藥期間及恢復(fù)期每日觀察記錄大鼠毛色、活動(dòng)、精神狀態(tài)、進(jìn)食飲水、大便等一般情況。定時(shí)記錄大鼠日采食量，并記錄灌胃后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d、37 d和44 d的體質(zhì)量，記錄大鼠行為學(xué)反應(yīng)、死亡數(shù)量及時(shí)間。30 d及45 d后，檢測(cè)血常規(guī)、電解質(zhì)及血生化指標(biāo)，測(cè)定臟器系數(shù)，觀察臟器病理學(xué)變化，進(jìn)行毒性作用結(jié)果分析。臟器系數(shù)計(jì)算公式：臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量（g）/動(dòng)物體質(zhì)量（g）×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件及Sigma-Plot繪圖軟件對(duì)觀測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以±s表示。采用單因素方差分析比較組間差異，方差齊時(shí)用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間多重比較，方差不齊時(shí)用Games-Howell法進(jìn)行組間比較，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DRR1活菌及其破碎物對(duì)大鼠體質(zhì)量和采食量的影響

2.1.1 DRR1給藥期間大鼠行為學(xué)變化

DRR1活菌及菌體破碎物給藥期間，除TGY組因灌胃操作失誤給藥至肺部，致一只大鼠死亡外，其余各組大鼠均存活，但未觀察到運(yùn)動(dòng)、呼吸異常，也未觀察到反應(yīng)遲鈍、瞳孔改變、眼球凸出、皮膚顏色改變等異?，F(xiàn)象，口、耳、鼻和眼角未見(jiàn)異常分泌物，排便及糞便形態(tài)也均正常。

2.1.2 DRR1給藥期間大鼠體質(zhì)量變化

給藥期及恢復(fù)期大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)數(shù)據(jù)列于表1。給予DRR1活菌或其破碎物后，受試大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)與TGY組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 DRR1給藥期及恢復(fù)期大鼠體質(zhì)量Table 1 Body weight of rats in period of DRR1 administration and recovery（±s,m/g）

表1 DRR1給藥期及恢復(fù)期大鼠體質(zhì)量Table 1 Body weight of rats in period of DRR1 administration and recovery（±s,m/g）

注：LDRH即DRR1高濃度（109/mL）給藥組，LDRL即DRR1低濃度（107/mL）組，BDRH即DRR1破碎物高濃度（109/mL）組，BDRL即DRR1破碎物低濃度（107/mL）組，TGY即對(duì)照組（用含0.5%胰蛋白胨、0.1%葡萄糖和0.3%酵母提取物的瓊脂培養(yǎng)液處理）。恢復(fù)期TGY組為7只（因第一周灌胃末期操作意外，死亡1只）。其余各組均8只。

組別TGY LDRH BDRH LDRL BDRL給藥期1 d 217.1±16.6 220.9±20.6 221.2±16.9 227.1±17.5 218.7±19.2 7 d 247.2±27.0 244.2±31.6 248.7±33.6 250.5±33.8 243.9±26.9 14 d 277.3±42.1 270.0±41.9 276.7±48.2 278.7±47.0 273.7±39.3 21 d 297.7±53.1 286.8±52.6 299.6±59.6 299.9±56.4 292.1±50.9 28 d 315.9±63.6 299.5±59.4 314.4±63.4 314.9±68.2 309.4±59.0恢復(fù)期37 d 340.9±71.2 305.1±56.8 343.4±69.8 330.8±68.5 335.8±74.2 44 d 350.4±81.3 312.8±62.2 354.8±78.9 336.5±75.9 343.4±80.9

2.1.3 DRR1給藥期間大鼠攝食量變化

給藥期及恢復(fù)期，DRR1活菌或其破碎物給藥組大鼠日平均攝食量與TGY組無(wú)顯著差異，（P＞0.05，表2）。

表2 DRR1活菌及其破碎物對(duì)大鼠日平均攝食量的影響Table 2 Effect of DRR1 live bacteria and its broken products on average daily food intake of rats（±s,m/g）

表2 DRR1活菌及其破碎物對(duì)大鼠日平均攝食量的影響Table 2 Effect of DRR1 live bacteria and its broken products on average daily food intake of rats（±s,m/g）

注：LDRH即DRR1高濃度（109/mL）給藥組，LDRL即DRR1低濃度（107/mL）組，BDRH即DRR1破碎物高濃度（109/mL）組，BDRL即DRR1破碎物低濃度（107/mL）組，TGY即對(duì)照組（用含0.5%胰蛋白胨、0.1%葡萄糖和0.3%酵母提取物的瓊脂培養(yǎng)液處理）?；謴?fù)期TGY組為7只，因第一周灌胃末期操作意外，死亡1只，其余各組均8只。

（組別TGY LDRH BDRH LDRL BDRL給藥期第1周19.45±4.76 18.49±4.16 19.74±6.46 19.62±4.90 19.15±4.64第2周20.37±7.05 19.17±3.00 20.63±6.41 19.83±4.22 20.67±3.92第3周18.75±7.19 18.86±3.99 20.41±6.00 20.33±3.58 19.95±3.48第4周18.49±8.15 18.28±3.25 19.63±5.73 19.81±4.29 19.71±4.59恢復(fù)期第5周20.06±7.07 19.30±3.76 20.82±6.68 20.67±3.49 20.75±4.59第6周17.33±9.53 18.74±3.46 20.29±6.50 20.03±3.92 19.81±5.01

2.2 DRR1活菌及其破碎物對(duì)大鼠血常規(guī)的影響

30 d給藥結(jié)束后，LDRH組大鼠的白細(xì)胞數(shù)有降低（P＜0.05），經(jīng)14 d停藥后，大鼠白細(xì)胞數(shù)恢復(fù)正常；紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體積以及血小板數(shù)無(wú)顯著變化（P＞0.05）；粒細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)及其百分比在給藥實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)無(wú)顯著變化（P＞0.05）；各DRR1給藥組與TGY組的淋巴細(xì)胞數(shù)比較，在給藥結(jié)束即刻以及14 d觀察期后，均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；給藥組內(nèi)，LDRL、BDRL與LDRH、BDRH比較有顯著升高（P＜0.05）（表3）。

表3 DRR1活菌及其破碎物給藥后大鼠血常規(guī)Table 3 Blood routinetest of ratsafter administration of DRR1 livebacteria and itsbroken products（±s）

表3 DRR1活菌及其破碎物給藥后大鼠血常規(guī)Table 3 Blood routinetest of ratsafter administration of DRR1 livebacteria and itsbroken products（±s）

注：LDRH即DRR1高濃度（109/mL）給藥組，LDRL即DRR1低濃度（107/mL）組，BDRH即DRR1破碎物高濃度（109/mL）組，BDRL即DRR1破碎物低濃度（107/mL）組，TGY即對(duì)照組（用含0.5%胰蛋白胨、0.1%葡萄糖和0.3%酵母提取物的瓊脂培養(yǎng)液處理）。與TGY組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與LDRH組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；同一列肩標(biāo)不同字母a和b表示兩個(gè)時(shí)間相比P＜0.05?；謴?fù)期TGY組n=7，其余各組均n=8。

血相白細(xì)胞/(109·L-1)淋巴細(xì)胞/(109·L-1)單核細(xì)胞/(109·L-1)粒細(xì)胞/(109·L-1)淋巴細(xì)胞百分比/%單核細(xì)胞百分比/%粒細(xì)胞百分比/%紅細(xì)胞/(1012·L-1)血紅蛋白/(g?L-1)紅細(xì)胞壓積/%平均紅細(xì)胞體積/f L血小板/(109·L-1)停藥后恢復(fù)時(shí)間0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d TGY 7.23±2.57 6.84±1.75 5.98±2.21 5.46±1.57 0.14±0.09 0.16±0.05 1.11±0.38 1.23±0.25 82.43±2.98 79.29±3.62 2.05±0.53 2.43±0.24 15.53±2.65 18.29±3.45 8.67±0.47 8.86±0.33 157.50±7.95 156.00±7.66 48.74±2.56 48.11±2.11 56.30±0.77 54.34±0.98 1 127.00±183.76 1 063.29±114.61 LDRH 5.55±1.36*6.11±2.06 4.40±1.17 4.63±1.48 0.13±0.05 0.14±0.05 1.02±0.39 1.35±0.65 79.00±6.50 76.06±6.13 2.26±0.44 2.51±0.40 18.74±6.12 21.43±5.89 8.44±0.28 8.79±0.61 153.10±3.93 155.25±8.51 46.88±1.34 46.61±2.51 55.62±1.75 53.14±1.64 1 113.20±144.30 1 002.75±67.90 BDRH 8.55±2.13a 7.73±2.07b 7.05±1.86a 5.94±1.69b 0.18±0.07 0.18±0.07 1.33±0.39 1.61±0.63 81.95±4.37 77.16±6.88 2.33±0.58 2.31±0.31 15.73±3.99 20.53±6.72 8.85±0.51 8.59±0.31 158.38±9.32 152.00±5.15 48.81±2.82 46.35±1.25 55.25±1.24 54.04±2.13 1 090.88±427.94 1 050.13±145.92 LDRL 8.89±2.73 8.99±1.96 7.18±2.42#7.16±1.35#0.20±0.08 0.16±0.09 1.51±0.41 1.65±0.82 72.38±19.59 79.14±5.61 2.58±0.71 2.16±0.23 17.55±3.79 18.70±5.43 8.74±0.99 8.81±0.68 154.88±18.87 153.88±7.36 48.50±5.25 47.36±2.42 55.61±1.55 53.95±2.24 1 100.75±411.57 1 123.25±129.30 BDRL 7.66±3.07 9.00±2.34 6.11±2.47#7.19±1.78#0.16±0.11 0.18±0.07 1.39±0.57 1.64±0.62 79.70±3.68 79.79±3.64 2.19±0.46 2.21±0.23 18.11±3.47 18.00±3.53 8.70±0.39 8.82±0.43 158.75±5.70 154.38±6.70 49.28±1.66 47.70±1.96 56.73±1.95 54.18±1.34 1 049.88±122.35 965.63±139.27

2.3 DRR1活菌及其破碎物對(duì)大鼠慢性毒性血生化指標(biāo)的影響

連續(xù)給藥30 d后，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）在給藥結(jié)束即刻及恢復(fù)14 d后，各給藥組與TGY組比較無(wú)顯著變化（P＞0.05）；而LDRH和BDRH組在恢復(fù)期ALT升高，LDRL恢復(fù)期ALT降低（P＜0.05）（表4）。谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）在停藥后即刻，LDRH組顯著升高，給藥各組內(nèi)與LDRH組比較有顯著降低，接近TGY組水平；恢復(fù)14 d后，LDRH組的AST恢復(fù)至TGY水平。堿性磷酸酶（ALP）在停藥后即刻，各給藥組與TGY組比較均無(wú)顯著變化（P＞0.05）；恢復(fù)14 d后，各給藥組與TGY組比較，ALP無(wú)顯著差異（P＞0.05）；恢復(fù)14 d后各給藥組與停藥后即刻各給藥組相比較，ALP顯著降低（P＜0.05）?？偟鞍祝═P）、尿酸（UA）、尿素（UREA）、鎂（Mg）在受試給藥期內(nèi)各組均無(wú)顯著變化（P＞0.05）。血糖（Glu）在停藥后即刻以及恢復(fù)14 d后，各給藥組與TGY組比較無(wú)顯著變化（P＞0.05）；恢復(fù)14 d后，LDRL、BDRL與LDRH組比較Glu明顯降低（P＜0.05）。肌酸激酶（CK）在停藥后即刻，LDRH組顯著升高（P＜0.05），恢復(fù)14 d后恢復(fù)至正常水平。肌酸激酶同工酶（CK-MB）在停藥后即刻，各給藥組與TGY比較，LDRH組有顯著升高（P＜0.05），與LDRH組比較BDRL組顯著降低（P＜0.05）；恢復(fù)14 d后，與TGY組比較，LDRH、BDRH組均有顯著升高（P＜0.05）。乳酸脫氫酶（LDH）在停藥后即刻，相比較于TGY組，LDRH組顯著升高（P＜0.01）；14 d恢復(fù)期后，與TGY組比較，各給藥組未見(jiàn)顯著差異（P＞0.05），但與停藥后即刻各相應(yīng)組比較顯著升高（P＜0.05）。血清磷（P）的水平在給藥結(jié)束后即刻以及恢復(fù)14 d后，各給藥組與TGY組比較無(wú)顯著變化（P＞0.05）；恢復(fù)期TGY、LDRH、BDRL各組血清磷的水平與停藥后即刻比較，均有降低（P＜0.05）。在給藥實(shí)驗(yàn)期兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)內(nèi)檢測(cè)受試大鼠血清生化指標(biāo)的變化，均在SD大鼠正常參考范圍內(nèi)［8］。

表4 DRR1活菌及其破碎物給藥后大鼠的血清生化指標(biāo)Table 4 Serum biochemical indexes of rats after administration of DRR1 live bacteria and its broken products（±s）

表4 DRR1活菌及其破碎物給藥后大鼠的血清生化指標(biāo)Table 4 Serum biochemical indexes of rats after administration of DRR1 live bacteria and its broken products（±s）

注：LDRH即DRR1高濃度（109/mL）給藥組，LDRL即DRR1低濃度（107/mL）組，BDRH即DRR1破碎物高濃度（109/mL）組，BDRL即DRR1破碎物低濃度（107/mL）組，TGY即對(duì)照組（用含0.5%胰蛋白胨、0.1%葡萄糖和0.3%酵母提取物的瓊脂培養(yǎng)液處理）。與TGY組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與LDRH組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；同一列肩標(biāo)不同字母a和b表示兩個(gè)時(shí)間相比，P＜0.05。恢復(fù)期TGY組n=7，其余各組均n=8。

血清生化谷丙轉(zhuǎn)氨酶/(U?L-1)谷草轉(zhuǎn)氨酶/(U?L-1)堿性磷酸酶/(U?L-1)總蛋白/(g?L-1)尿酸/(μmol?L-1)尿素/(mmol?L-1)葡萄糖/(mmol?L-1)肌酸激酶/(U?L-1)鎂/(mmol?L-1)磷/(mmol?L-1)肌酸激酶同工酶/(U?L-1)乳酸脫氫酶/(U?L-1)給藥后時(shí)間0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d TGY 35.74±3.74 38.60±7.26 92.91±11.42 94.53±18.03 154.84±62.60a 126.71±48.99b 59.70±2.88 63.29±2.84 82.18±9.45 58.66±6.06 7.88±1.09 7.23±0.97 7.59±1.58 7.31±0.66 429.45±105.18 398.31±183.20 1.05±0.19 1.03±0.19 3.63±1.27a 2.13±0.66b 222.53±77.40 172.52±43.18 240.50±98.31a 646.07±121.56b LDRH 38.51±5.01a 40.06±9.30b 137.68±26.30**a 93.38±22.79b 155.14±49.66a 118.55±58.88b 58.78±3.08 61.00±1.89 83.04±12.49 60.86±10.41 7.92±1.36 7.91±1.03 6.51±0.66 7.78±0.36 697.47±193.38*a 480.55±52.94b 1.07±0.10 1.08±0.20 2.61±0.26a 1.76±0.75b 325.28±86.38*278.83±97.58*392.69±119.31**a 658.20±227.18b BDRH 38.55±5.22a 43.29±6.65b 110.96±22.07a 96.86±13.89b 130.53±41.57a 115.54±56.84b 58.99±4.24 62.35±2.83 76.75±9.95 69.55±10.45 7.43±0.80 6.77±0.96 6.98±0.89 7.71±0.45 607.49±196.76a 449.17±178.86b 0.99±0.09 0.91±0.09 2.74±0.35 2.34±0.42 307.46±104.23 295.37±93.62**342.48±132.26a 651.57±254.23b LDRL 38.20±5.77a 29.13±5.33b 105.32±16.21#93.99±16.92 138.28±64.71a 100.58±42.66b 59.23±3.83 62.43±3.68 83.48±15.66 64.85±11.09 6.93±0.58 6.75±0.74 6.89±0.60 6.86±0.54#551.60±166.30 500.63±223.71 0.97±0.06 0.91±0.07 2.88±0.26 2.28±0.69 270.05±97.11 216.52±36.79 271.78±95.67#a 590.10±237.34b BDRL 32.36±4.70 31.75±7.28 97.23±17.69##96.30±17.37 120.29±59.87 108.41±51.08 58.85±3.69 61.64±3.11 71.55±20.96 57.69±10.20 6.83±1.80 7.13±1.25 6.91±0.46 6.92±0.55#423.45±84.94##365.03±180.07 0.93±0.11 0.92±0.08 4.11±3.12a 2.19±0.66b 219.65±62.12#200.20±29.64 240.76±93.99##a 597.46±312.35b

2.4 DRR1活菌及其破碎物對(duì)大鼠慢性毒性電解質(zhì)的影響

給藥30 d后停藥即刻，DRR1各組大鼠的血清電解質(zhì)與TGY組比較，差異均不顯著；與LDRH組比較，BDRH組、BDRL組、LDRL組的血清Cl-含量降低（P＜0.05），但都在生理參考范圍內(nèi)。14 d恢復(fù)期后，與TGY組比較，LDRH組、BDRH組的血清pH值、Na+含量明顯升高（P＜0.05），血清Cl-、Ca2+水平降低（P＜0.05），而血清K+未發(fā)生顯著改變（P＞0.05）（表5）。

表5 DRR1活菌及其破碎物給藥后大鼠血清電解質(zhì)的變化Table5 Changesof serum electrolytesin ratsafter administration of DRR1 livebacteria and itsbroken products（±s）

表5 DRR1活菌及其破碎物給藥后大鼠血清電解質(zhì)的變化Table5 Changesof serum electrolytesin ratsafter administration of DRR1 livebacteria and itsbroken products（±s）

注：LDRH即DRR1高濃度（109/mL）給藥組，LDRL即DRR1低濃度（107/mL）組，BDRH即DRR1破碎物高濃度（109/mL）組，BDRL即DRR1破碎物低濃度（107/mL）組，TGY即對(duì)照組（用含0.5%胰蛋白胨、0.1%葡萄糖和0.3%酵母提取物的瓊脂培養(yǎng)液處理）。與TGY組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與LDRH組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；同一列肩標(biāo)不同符號(hào)a和b表示P＜0.05；恢復(fù)期TGY組n=7，其余各組均n=8。

血清離子K+/(mmol?L-1)Na+/(mmol?L-1)Cl-/(mmol?L-1)Ca2+/(mmol?L-1)pH值停藥后時(shí)間0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d TGY 4.36±0.35 3.96±0.24 140.63±1.08 140.53±0.96 107.93±1.49 107.31±1.34 2.67±0.05 2.60±0.06 6.81±1.77 7.46±0.03 LDRH 4.08±0.45 3.83±0.17 141.33±1.48 143.13±0.78**109.59±1.43 104.69±1.34*2.62±0.05a 2.36±0.06**b 7.42±0.03 7.51±0.02**BDRH 3.94±0.34 4.07±0.28 140.61±0.99 142.45±0.80**106.79±1.26##105.15±1.38 2.61±0.10 2.45±0.07 7.43±0.05 7.52±0.02**LDRL 4.22±0.38 3.96±0.42 140.66±0.68 142.17±1.33 107.13±1.10#105.71±1.94 2.62±0.12 2.54±0.17##7.44±0.03 7.51±0.04 BDRL 4.02±0.15 4.02±0.22 141.01±0.84 140.54±0.86##107.38±1.90#106.39±0.93 2.62±0.04 2.60±0.04##7.44±0.02 7.47±0.02

2.5 DRR1活菌及其破碎物對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響

給藥30 d后，停藥即刻及停藥14 d后的臟器系數(shù)見(jiàn)表6。與TGY組比較，受試大鼠除LDRH組的心臟臟器系數(shù)有顯著降低（P＜0.05）外，其他各臟器的臟器系數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表6 DRR1活菌及其破碎物給藥后大鼠的各臟器系數(shù)Table6 Organ coefficientsof ratsafter administration of DRR1 livebacteria and itsbroken products（±s,%）

表6 DRR1活菌及其破碎物給藥后大鼠的各臟器系數(shù)Table6 Organ coefficientsof ratsafter administration of DRR1 livebacteria and itsbroken products（±s,%）

注：LDRH即DRR1高濃度（109/mL）給藥組，LDRL即DRR1低濃度（107/mL）組，BDRH即DRR1破碎物高濃度（109/mL）組，BDRL即DRR1破碎物低濃度（107/mL）組，TGY即對(duì)照組（用含0.5%胰蛋白胨、0.1%葡萄糖和0.3%酵母提取物的瓊脂培養(yǎng)液處理）。與TGY組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與LDRH組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；恢復(fù)期TGY組n=7，其余各組均n=8。

臟器名稱(chēng)心肝脾肺腎腦胸腺停藥后時(shí)間0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d 0 d 14 d TGY 0.33±0.03 0.29±0.03 2.81±0.29 2.77±0.25 0.21±0.05 0.19±0.02 0.46±0.05 0.49±0.07 0.65±0.05 0.61±0.06 0.67±0.14 0.52±0.08 0.14±0.02 0.16±0.16 LDRH 0.30±0.01*0.29±0.03 2.73±0.20 2.87±0.35 0.22±0.04 0.22±0.03 0.51±0.08 0.50±0.07 0.64±0.09 0.65±0.05 0.60±0.11 0.59±0.12 0.14±0.06 0.15±0.02 BDRH 0.30±0.02 0.30±0.04 2.95±0.19 2.77±0.16 0.21±0.04 0.22±0.04 0.50±0.07 0.48±0.04 0.67±0.06 0.60±0.03 0.63±0.12 0.49±0.15 0.14±0.02 0.13±0.04 LDRL 0.32±0.02 0.31±0.05 2.76±0.24 2.86±0.08 0.21±0.03 0.20±0.01 0.49±0.09 0.52±0.09 0.66±0.06 0.64±0.03 0.62±0.14 0.56±0.13 0.15±0.04 0.14±0.05 BDRL 0.33±0.03#0.29±0.02 2.77±0.25 2.98±0.18 0.23±0.03 0.20±0.03 0.49±0.07 0.49±0.05 0.68±0.06 0.61±0.08 0.68±0.09 0.51±0.09 0.14±0.02 0.12±0.03

2.6 DRR1活菌及其破碎物對(duì)大鼠主要臟器的病理學(xué)影響

給藥30 d后停藥即刻，可見(jiàn)心肌細(xì)胞排列規(guī)則，偶見(jiàn)心肌細(xì)胞間微血管擴(kuò)張充血（箭頭所示），未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及心肌細(xì)胞水腫變性等病理改變（圖1A1、A3）；停藥14 d后，可見(jiàn)心肌細(xì)胞排列規(guī)則，偶見(jiàn)心肌細(xì)胞間微血管擴(kuò)張充血（箭頭所示），與正常大鼠心臟病理學(xué)結(jié)構(gòu)一致（圖1A2、A4）。給藥30 d后停藥即刻，可見(jiàn)肝小葉肝細(xì)胞排列整齊，偶見(jiàn)部分肝細(xì)胞輕微腫脹，匯管區(qū)微靜脈充血（圖1B1、B3）；停藥14 d后，可見(jiàn)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，偶見(jiàn)匯管區(qū)微靜脈充血（箭頭所示），與正常組織結(jié)構(gòu)一致（圖1B2、B4）。給藥30 d停藥后即刻，偶見(jiàn)腎小球及部分近曲小管上皮細(xì)胞腫脹，腎小球囊腔狹窄（圖1C1、C3）；停藥14 d后，可見(jiàn)腎小球囊腔清晰（箭頭所示），腎小球結(jié)構(gòu)完整，腎小管上皮細(xì)胞腫脹減輕（圖1 C2、C4），髓質(zhì)部未見(jiàn)上皮細(xì)胞腫脹及微小靜脈擴(kuò)張充血，與正常組織結(jié)構(gòu)一致。

給藥30 d后停藥即刻及停藥14 d后，肺臟病理形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)均未見(jiàn)病理學(xué)變化（圖1D1、D2、D3、D4）。心臟、肝臟、腎臟、肺與正常大鼠組織結(jié)構(gòu)比較（圖1A0、B0、C0、D0），給藥30 d后停藥即刻及停藥14 d后，均未見(jiàn)實(shí)質(zhì)性病理學(xué)改變。

圖1 DRR1活菌及破碎物高濃度給藥大鼠主要臟器的病理學(xué)變化（HE染色）Figure 1 Pathology of main organs in rats treated with high concentration of DRR1 live bacteria and its broken products（HE staining）

3 討論

DR具有很強(qiáng)的輻射與放射抗性，同時(shí)具有強(qiáng)抗氧化、抗干燥、抗強(qiáng)化學(xué)誘變劑和抗強(qiáng)紫外線(xiàn)的特性。DR的pprI、pprM基因能夠在畢赤酵母以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞株或小鼠體內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，并發(fā)揮抗氧化與抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用［9-11］。鑒于DR特有的DNA損傷強(qiáng)修復(fù)能力，DR體內(nèi)抗氧化保護(hù)酶系相關(guān)基因的高水平表達(dá)，以及其復(fù)雜的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，可以推測(cè)DR在生命科學(xué)中有很廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)現(xiàn)DRR1已60多年，國(guó)內(nèi)研究者就其抗輻射相關(guān)基因群、相關(guān)蛋白因子以及抗氧化應(yīng)激酶系統(tǒng)進(jìn)行了原核基因重組轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞、電轉(zhuǎn)化人類(lèi)腫瘤細(xì)胞株及小鼠等方面的研究，均獲得了可喜成果［12-17］。臨床上已將雙岐桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片（金雙岐）用于調(diào)節(jié)腸道菌群，可治療腸道菌群失調(diào)引起的腹瀉、慢性腹瀉及便秘。那么，DR是否也能以活菌片的形式應(yīng)用于臨床，調(diào)節(jié)腸道菌群或者增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能？基于這種想法，本研究組就DR標(biāo)準(zhǔn)菌DRR1活菌及其代謝產(chǎn)物、菌體破碎物的毒性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，將109/mL DRR1活菌，以0.4 mL/10 g體質(zhì)量，24 h內(nèi)間隔6 h，連續(xù)3次灌胃KM小鼠，觀察48 h，未見(jiàn)小鼠死亡及其他中毒癥狀；又以109/mL DRR1活菌，間隔8 h連續(xù)灌胃2次后，觀察14 d，未檢測(cè)到小鼠的毒性反應(yīng)（結(jié)果待發(fā)表）。在此急性毒性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究組進(jìn)行了大鼠的慢性毒性實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)中給予大鼠不同濃度的DRR1活菌及其破碎物，實(shí)驗(yàn)期間除1只大鼠（對(duì)照組內(nèi)大鼠）因灌胃操作不當(dāng)致死外，其余大鼠均被毛光滑，飲食、活動(dòng)、排泄等未見(jiàn)異常、未見(jiàn)眼角有異常內(nèi)分泌物。給藥30 d結(jié)束后及停藥14 d后，深度麻醉大鼠，進(jìn)行各指標(biāo)的毒理學(xué)檢測(cè)，各主要臟器肉眼觀察無(wú)大體病理學(xué)變化。白細(xì)胞數(shù)在大鼠中給予高濃度DR活菌時(shí)有一過(guò)性的降低，但2周后恢復(fù)正常。與TGY組比較，LDRH組大鼠的血清AST、CK、CK-MB、LDH值均有所升高；停藥14 d后除CK-MB、LDH外，其余均恢復(fù)至正常水平。血清離子濃度在給藥30 d結(jié)束后，未發(fā)生顯著變化；但在停藥14 d時(shí)出現(xiàn)了波動(dòng)，表現(xiàn)在Cl-、Ca2+降低，而Na+、pH升高。為檢查這種變化對(duì)相關(guān)臟器是否存在器質(zhì)性損傷，研究組在給藥30 d后即刻以及停藥14 d，對(duì)給予高濃度DRR1活菌以及高濃度DRR1菌體破碎物的大鼠的心、肝、肺、腎進(jìn)行了病理學(xué)檢查；鏡檢發(fā)現(xiàn)，30 d給藥結(jié)束時(shí)即刻及停藥14 d后，心臟、肝臟、腎臟、肺未觀察到實(shí)質(zhì)性病理改變，證實(shí)DRR1菌對(duì)各臟器未發(fā)生毒副作用。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了文獻(xiàn)所述，DRR1菌為革蘭陽(yáng)性菌，無(wú)致病性［18］。

雖然不斷有研究表明益生菌有抑制腫瘤生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)腸道菌群、提高機(jī)體免疫力等多種生理功能，但由于目前對(duì)益生菌的作用機(jī)制及其安全性的研究還不夠深入，尚有許多機(jī)制未完全闡明，因此益生菌作為藥品使用時(shí)，其品種規(guī)格與數(shù)量在市場(chǎng)上仍然很少，主要應(yīng)用尚限于食品和保健品行業(yè)［19］。本次大鼠慢性毒性實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了DRR1對(duì)生物機(jī)體的安全性，證明DRR1對(duì)大鼠無(wú)實(shí)際毒性。本研究為DRR1活菌或菌體破碎物在食品醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的推廣應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。