胡志斌,黃 纓,丁玉強

(1.復旦大學實驗動物科學部,上海200032;2.復旦大學腦科學研究院,上海200032)

腦缺血（cerebral ischemic）是指腦內(nèi)血流不足以滿足大腦正常代謝需求的病理生理狀態(tài)。腦內(nèi)血流量突然減少或腦內(nèi)代謝速率迅速增加均可導致腦缺血。腦缺血常常會造成不同程度的腦損傷，因此被認為與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)［1-2］。根據(jù)病因，腦缺血可分為血栓型、栓塞型和低灌注型［3］；根據(jù)缺血區(qū)域，腦缺血可分為局灶性缺血和全腦性缺血［4］。臨床上，腦缺血性疾病約占所有腦血管疾病的80%［5］。現(xiàn)有的流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，近年來我國居民腦卒中患病率約為2%［6］。《中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報告（2015年）》也顯示，我國腦卒中患者死亡率約占總死亡率的22%，其中缺血性腦卒中的發(fā)病率約占全部腦卒中的69.6%［7］。因此，針對腦缺血性疾病的研究非常重要。

為了更好地理解腦缺血的發(fā)病機制以及尋找有效治療方法，多種腦缺血動物模型被開發(fā)，并成為研究不同腦缺血性疾病的重要在體研究手段。有關(guān)腦卒中流行趨勢和相關(guān)動物模型的制作方法、影像學特點等在國內(nèi)外已有很多文獻發(fā)表［8-10］。本文重點介紹不同動物類型的腦缺血模型研究進展，以及全腦、局灶性相關(guān)腦缺血動物模型的種類、制備方法、特點及應用范圍，并對造模動物的感覺運動行為學及組織學評估實驗進行概述，以期為腦缺血動物模型的選擇和應用提供參考。

1 腦缺血模型實驗動物的選擇

目前，已有多種實驗動物被應用于制備腦缺血模型，包括嚙齒類動物、非人靈長類動物、兔、豬等。

嚙齒類動物中，小鼠由于個體小、繁殖快、成本低、方便進行基因修飾等優(yōu)勢，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域多個方面的研究中應用最廣泛，其中也包括用于評估腦缺血的分子機制研究［11-13］。有研究者對不同遺傳背景小鼠品系的雙頸總動脈閉塞模型進行系統(tǒng)性比較研究，結(jié)果提示在最常用的7個遺傳背景小鼠中，C57BL/6品系造模小鼠可出現(xiàn)典型的缺血癥狀，以及嚴重的皮層微灌注減少，而且不同個體之間組織學損傷重復性最高［14］。

大鼠的腦皮層和基底神經(jīng)節(jié)血管系統(tǒng)及其生理學特點與人類非常類似。相對于小鼠及其他動物，大鼠體型大小適中，更便于監(jiān)測生理參數(shù)及進行其他觀察，也容易進行重復性研究。因此，大鼠是腦缺血研究中最常用的動物之一［15-16］。然而，不同品種品系大鼠在腦缺血造模時也存在一定差異［10］。2013年的大鼠腦缺血建模相關(guān)薈萃分析結(jié)果顯示，使用相同品系大鼠構(gòu)建的腦缺血模型具有相對同質(zhì)性，其中Wistar大鼠的腦部梗死灶面積變異度最低［17］。

此外，蒙古沙鼠（長爪沙鼠）由于缺乏頸動脈與椎-基底動脈循環(huán)之間的聯(lián)系，阻斷其頸總動脈很容易造成其腦缺血，所以很早就被用來制備腦缺血模型并進行腦缺血相關(guān)機制的研究［18］。

非人靈長類動物作為與人類親緣關(guān)系最近的一類動物，其腦部結(jié)構(gòu)與人類非常相似，是進行腦缺血研究最理想的模型實驗動物［19-21］。例如，很多神經(jīng)遞質(zhì)保護藥物的臨床研究失敗，主要原因之一是由于嚙齒類動物的白質(zhì)體積很小，從嚙齒類動物模型研究中獲得的實驗數(shù)據(jù)與臨床患者中的實際情況有很大區(qū)別［22］。而非人靈長類動物的腦組織中白質(zhì)體積大，研究結(jié)果提示其慢性低灌注模型可以很好地模擬臨床患者出現(xiàn)的神經(jīng)膠質(zhì)細胞激活及白質(zhì)變化，比如纖維膠質(zhì)酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）陽性星形膠質(zhì)細胞數(shù)量增加，或是皮層炎性因子表達水平增加，或是神經(jīng)元軸突髓鞘異常等［23-24］。

然而，非人靈長類動物的飼養(yǎng)成本高，且存在較多倫理爭議，難以在多種條件下進行相關(guān)研究。為了克服這些局限性，研究人員也常利用多種其他動物（包括兔、羊、豬等）來制備腦缺血性疾病模型，從而進行診斷及治療方面的臨床前研究［25-26］。例如，有研究者通過觀察腦缺血兔模型的脊髓運動神經(jīng)元電生理性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)脊髓運動神經(jīng)元可能與腦癱瘓時出現(xiàn)的肌肉僵硬有很大關(guān)聯(lián)［25］。

2 全腦缺血動物模型

全腦缺血是指腦內(nèi)全部或大部分血管中血流量降低，可分為完全性缺血和不完全性缺血。目前，常用的全腦缺血模型有雙血管閉塞/低壓模型、四血管閉塞模型和三血管閉塞模型。

2.1 雙血管閉塞/低壓模型

Ekl?f等［27］首次制備了雙血管閉塞/低壓模型（圖1A），在阻斷大鼠雙側(cè)頸總動脈的同時，通過放血或使用降壓藥物降低大鼠血壓；待血壓降低至約50 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）時，通過控制雙側(cè)頸總動脈處止血夾的開閉，實現(xiàn)生理水平上具有顯著變化的腦缺血和再灌注。之后，Sanderson等［28］對該模型進行了改進，他們首先從大鼠動脈抽出7～9 mL血液，再用止血夾閉塞頸動脈，8 min后通過輸血或抽血將平均動脈壓控制在30 mmHg左右，以此誘導全腦缺血，然后取下止血夾、回輸血液，可實現(xiàn)再灌注過程；該模型降低了實驗動物的死亡率。

雙血管閉塞/低壓模型具有操作簡單、便于控制再灌注和檢測生理變化等優(yōu)點，然而閉塞過程會使得大鼠全身血流量降低，繼而損傷心臟等其他重要器官。目前，該模型主要被應用于缺血性腦疾病的發(fā)病機制研究和抗腦缺血藥物的藥效觀察［29］。

2.2 四血管閉塞模型

Pulsinelli等［30］最早制備出四血管閉塞模型（圖1B），即在大鼠頸部腹側(cè)正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈并放置止血扣；在大鼠枕骨后方切口，暴露第一頸椎左右橫突孔，將電灼針頭插入兩橫突孔，永久性閉塞雙側(cè)椎動脈；通過控制止血扣的開閉，在清醒的大鼠中實現(xiàn)腦缺血和再灌注。由于難以驗證第一頸椎左右橫突孔中椎動脈閉塞是否完全，因此Sugio等［31］嘗試通過在第二頸椎左右橫突孔進行電灼以阻斷雙側(cè)椎動脈，發(fā)現(xiàn)實驗結(jié)果可視化增強，提高了實驗的成功率。接著，研究者又對該建模方法做了一些優(yōu)化。例如，范圣登等［32］用雙極電凝器凝固橫突孔表面的結(jié)締組織，并用鋼絲插入橫突孔間接電灼以閉塞椎動脈，從而減少椎動脈出血；李兵等［33］用微型磨鉆擴大第一頸椎橫突孔，充分暴露椎動脈后將其閉塞，增強了建模的可操作性。

四血管閉塞模型因具有缺血完全的優(yōu)點，能夠較好地模擬臨床上因休克、低血壓而造成的腦缺血損傷過程，但其手術(shù)操作相對復雜，術(shù)中完全閉塞椎動脈對腦內(nèi)血流量影響較大，使得再灌注不完全。目前，該模型主要被應用于腦缺血后認知功能方面的研究，以及抗腦缺血藥物的藥效評價［34］。

2.3 三血管閉塞模型

Kameyama等［35］最先制備出三血管閉塞模型（圖1C），即通過在大鼠頸前區(qū)切口，分離胸骨舌骨肌和肩胛舌骨肌后，暴露出枕骨并開骨窗，通過骨窗從周圍組織中分離出基底動脈，經(jīng)電灼將其永久性閉塞；在確保大鼠神經(jīng)功能未損傷的情況下，通過控制雙側(cè)頸總動脈處止血夾的開閉，實現(xiàn)全腦缺血和再灌注過程。隨后，Panahian等［36］用特制的微型止血夾代替電灼，阻斷大鼠基底動脈；該模型在不損傷基底動脈的情況下，重現(xiàn)性較好，但因手術(shù)難度較大而應用范圍有限。Thal等［37］用細雙極鉗切斷小鼠基底動脈，并在10 d后對存活的小鼠進行10 min短暫的雙側(cè)頸總動脈閉塞；該模型技術(shù)上可行，重現(xiàn)性好。

三血管閉塞模型具有重現(xiàn)性好、成功率高、對其他臟器損傷小等優(yōu)點，然而手術(shù)難度較大，操作不當易致死。目前，該模型主要被應用于研究腦缺血過程中神經(jīng)元的損傷機制［19，36］。

除了上述3種常用模型外，還有大鼠頸動脈分流模型［38］，但由于手術(shù)操作難度較大、成功率低而應用受限。此外，在靈長類動物和其他大型動物（例如兔、狒狒、獼猴等）中也有相應的模型［19］，但因飼養(yǎng)成本較高或與人腦構(gòu)造存在差異等問題，尚未成為主流模型。

3 局灶性缺血模型

局灶性缺血是指在腦內(nèi)特定區(qū)域血流量降低，是人類腦缺血性疾病發(fā)作的常見類型。迄今為止，人們對局灶性腦缺血模型的研究較多，也更為深入。缺血性腦卒中主要影響大腦中動脈的正常生理功能，因此現(xiàn)有腦卒中動物模型主要針對該血管的阻斷進行研究。目前，常用的模型有開顱閉塞模型、線栓閉塞模型、血栓栓塞模型、光化學誘導模型、FeCl3誘導模型和內(nèi)皮素-1誘導模型。

3.1 開顱閉塞模型

Tamura等［39］最早建立開顱閉塞模型（圖2A），通過分離大鼠顳肌后用牙鉆進行顳下顱骨切除，再通過電凝切斷大腦中動脈近端，實現(xiàn)大腦中動脈的永久性閉塞，造成局灶性腦缺血，缺血性損傷常發(fā)生在大腦皮質(zhì)區(qū)域。Bederson等［40］在暴露大鼠左側(cè)中動脈后，用微雙極電凝在不同部位進行閉塞，發(fā)現(xiàn)閉塞效果及大鼠神經(jīng)功能的變化程度與閉塞部位有關(guān)，在近端閉塞大腦中動脈會造成更嚴重的皮質(zhì)及皮質(zhì)下區(qū)損傷。近年來，又有一系列研究對該模型進行了改進，例如在暴露大腦中動脈后可通過動脈壓迫、動脈瘤夾或線圈將其閉塞，以實現(xiàn)短暫的局灶性腦缺血［41］。

開顱閉塞模型具有重現(xiàn)性好、易于控制血管閉塞位置及程度、與人的腦梗死病理改變相近等特點，然而手術(shù)難度較大，易造成顱腔感染，不利于實現(xiàn)再灌注過程。目前，該模型主要被用于研究不可逆性腦缺血的病理機制及抗腦缺血藥物的藥效［42］。

3.2 線栓閉塞模型

線栓閉塞模型具有重現(xiàn)性好、不需要開顱、易于控制缺血和再灌注過程時間等優(yōu)點，然而手術(shù)操作難度較大、過程不能可視化，易造成蛛網(wǎng)膜下腔出血。該模型目前主要被用于研究可逆性腦缺血的病理機制，也有被用來評估不同品系動物之間腦缺血程度的差異［47-48］。

3.3 血栓栓塞模型

Kudo等［49］最先制備出血栓栓塞模型（圖2C），即通過心臟穿刺取血，體外凝結(jié)形成血凝塊，隨后暴露大鼠左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，用微血管夾和細線分別暫時性閉塞頸外動脈起始部位和頸總動脈近分叉部位，將血凝塊與生理鹽水（即0.9%NaCl溶液）混勻后注射入頸總動脈內(nèi)，之后解除閉塞恢復血流，從而制備血栓引起的局灶性腦缺血模型。然而，該實驗中血凝塊大小不一，難以確定其最終流向和閉塞部位。為了解決這一問題，DiNapoli等［50］通過微導管直接將血凝塊注入大鼠大腦中動脈起始部位，同時使用激光多普勒血流儀檢測血流變化，從而提高了血栓放置的準確性和實驗結(jié)果的可重復性。Orset等［51］在收縮小鼠右側(cè)顳肌并開顱暴露其中動脈后，通過注射凝血酶產(chǎn)生局部纖維蛋白凝塊，形成原位血栓，20 min后再經(jīng)尾靜脈注射組織型纖溶酶原激活物以溶栓，實現(xiàn)腦缺血和再灌注過程。Chen等［52］在避免開顱和穿透硬腦膜的情況下，通過導管將血凝塊和凝血酶經(jīng)右側(cè)頸外動脈精確輸送至大腦中動脈處，形成穩(wěn)定的血栓。

血栓栓塞模型具有與人類腦血栓病理機制相近的特點，但是存在難以控制血凝塊的穩(wěn)定性的問題，并且血流較大時血凝塊易被沖散，從而造成其他側(cè)支血管堵塞。該模型目前主要被用于溶栓干預和溶栓藥物的研究［15，53］。

3.4 光化學誘導模型

孟加拉玫瑰紅是一種Ⅱ型光敏劑，光激活后可直接將能量轉(zhuǎn)移至氧分子，并產(chǎn)生大量的活性氧，從而與生物體內(nèi)其他分子相互作用，進而造成機體損傷［54］。Watson等［55］最早使用孟加拉玫瑰紅制備局灶性腦缺血模型（圖2D），即通過尾靜脈注射含孟加拉玫瑰紅的生理鹽水溶液，再暴露出大鼠的頭骨，隨后用波長為560 nm的光束照射其左側(cè)頂蓋骨，誘導血栓形成，從而造成局部梗死，實現(xiàn)缺血過程。Ikeda等［20］使用該方法對靈長類動物進行造模，即在麻醉普通狨猴后，靜脈注射孟加拉玫瑰紅，然后暴露其頭骨，以左側(cè)大腦皮層感覺運動區(qū)為靶點進行綠光照射，造成局部腦缺血，并通過相關(guān)行為實驗評估普通狨猴生理功能的恢復情況。光化學誘導法也可用于建立因缺血而導致的脊髓損傷模型［56］。

圖2 局灶性缺血動物模型制備示意圖Figure2 Diagrams of craniotomy and mechanical occlusion(A),filament occlusion(B),thrombus occlusion(C),photothrombosis-induced occlusion(D),FeCl3-induced occlusion(E),and endothelin-1-induced occlusion(F)in global cerebral ischemia in laboratory animals

光化學誘導法具有避免開顱、重現(xiàn)性好、操作簡單等優(yōu)點，然而由于光照僅在皮質(zhì)表面，血栓只在動脈末梢和毛細血管中產(chǎn)生，這與臨床上血栓的影響范圍差別較大。因此，也有研究結(jié)合腦部埋管技術(shù)，將光纖送入腦中特定的部位（例如紋狀體），實現(xiàn)定點造模，并對該特定范圍的腦部血栓進行針對性研究［57］。此外，使用不同波長的光源進行光化學誘導造模，效果也可能會有很大不同。例如，有研究結(jié)果顯示，同樣條件下473 nm較565 nm和593 nm波長，能引起更大面積的梗死灶［58］。目前，該模型主要被用于評估溶栓藥物的藥效，以及研究具有保護神經(jīng)元作用的分子及其機制［21］。

3.5 FeCl3誘導模型

FeCl3是一種電解質(zhì)，將血管暴露于其中，可通過產(chǎn)生活性氧的機制觸發(fā)血管內(nèi)壁損傷和內(nèi)皮剝離，從而激活血小板，產(chǎn)生組織因子，誘發(fā)凝血級聯(lián)反應，促使血管內(nèi)形成血栓［59］。Karatas等［13］最早使用FeCl3閉塞大腦中動脈（圖2E），即通過手術(shù)暴露小鼠頭骨，在不損傷硬腦膜的基礎上，用高速鉆頭在顴弓和鱗骨交界處開一骨窗，然后將浸泡于10%FeCl3溶液中的濾紙條經(jīng)骨窗，緊貼硬腦膜，放置于小鼠大腦中動脈遠端，3 min即可誘導血栓形成且不損害動脈周圍皮質(zhì)，10 min內(nèi)可使得局部腦血流量迅速下降，17 min左右可實現(xiàn)大腦中動脈的完全閉塞。盡管這一模型能夠形成穩(wěn)定的血栓，但缺少動物腦缺血后功能的深入評價。為此，Syeara等［60］將20%FeCl3的濾紙條經(jīng)頂骨上的骨窗閉塞小鼠大腦中動脈4 min后，移除濾紙條并擦干，隨后用骨蠟封閉骨窗，并對小鼠進行14 d的運動功能測試；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠只有輕微的一過性運動障礙，提示該模型可能不適于以運動功能為主要結(jié)果指標的實驗研究。此外，F(xiàn)eCl3也可用于誘導頸動脈和腸系膜上靜脈、動脈血栓的形成［61］。

社會主義發(fā)展新時期，我國城市化建設進程日益加速，建筑工程不斷增多，由此引發(fā)的能源消耗問題越發(fā)突出，甚至部分地區(qū)已然接近城市所能提供的能源極限。在這樣的時代背景下，建筑節(jié)能設計勢在必行，是促進社會、自然和諧發(fā)展的有效舉措，并在改善人居環(huán)境方面發(fā)揮了巨大優(yōu)勢，越來越多地受到人們的關(guān)注和喜愛。在此過程中，建筑節(jié)能設計需從多個方面進行考量，在因地制宜的原則導向下，選擇科學的踐行措施。

FeCl3誘導模型具有死亡率低、創(chuàng)傷小、價格低廉、易于活體顯微操作等優(yōu)點，然而FeCl3濃度、動物遺傳背景和其他環(huán)境變量等均易對該模型產(chǎn)生顯著影響。目前，該模型主要被用于研究溶栓藥物，以及評估神經(jīng)保護藥物的藥效［13］。

3.6 內(nèi)皮素-1誘導模型

內(nèi)皮素-1是一種強效的內(nèi)源性血管收縮肽，與內(nèi)皮素受體結(jié)合后可通過G蛋白偶聯(lián)受體介導的信號通路調(diào)節(jié)細胞收縮，從而在宏觀上造成血管收縮，組織內(nèi)局部注射內(nèi)皮素-1可造成缺血性損傷［62］。Macrae等［63］首次建立內(nèi)皮素-1誘導模型（圖2F），即通過將內(nèi)皮素-1注射到大鼠左側(cè)大腦中動脈外膜附近，并用氫清除法測定紋狀體血流量，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素-1可引起劑量依賴性的腦缺血損傷，造成明顯且持久的血管收縮現(xiàn)象，隨后伴有緩慢的自發(fā)性再灌注過程。Sharkey等［64］在此基礎上，利用立體定位技術(shù)標準化注射部位，降低了該模型的可變性誤差。由于豬腦具有與人腦解剖結(jié)果高度相似的特點，Zhang等［26］對丹麥家豬進行開顱，將內(nèi)皮素-1注射入皮質(zhì)區(qū)，并通過神經(jīng)功能評價和磁共振成像掃描，成功制備出豬的局灶性腦缺血模型。

內(nèi)皮素-1誘導模型具有操作簡便、損傷小和針對性強等特點，然而難以控制自發(fā)性再灌注，使得閉塞時間有限，重復性較差。目前，該模型主要被用于研究藥物等對腦缺血過程中神經(jīng)的保護作用。例如，阿爾茲海默癥是一種常見的年齡相關(guān)的神經(jīng)變性疾病，主要病理改變是淀粉樣蛋白在腦內(nèi)沉積以及神經(jīng)元丟失。一項利用內(nèi)皮素-1造模的研究發(fā)現(xiàn)，損傷腦內(nèi)血管可加速淀粉樣蛋白的腦內(nèi)沉積和神經(jīng)元的丟失，而阿魏酸可通過防止血管損傷逆轉(zhuǎn)上述病理過程，為阿爾茲海默癥的治療提供了新的思路［65］。

4 腦缺血動物模型相關(guān)行為學評估

腦的各部位存在功能差異，例如海馬或杏仁核與記憶有很大關(guān)聯(lián)，而前額葉皮層在包括情緒、決策和認知等協(xié)調(diào)性思維和行動中作用重要［66］。如同腦卒中患者，腦缺血模型動物也會在行為上出現(xiàn)神經(jīng)損傷癥狀，特別是感覺運動方面的缺陷［16］。即使在同一損傷部位，腦缺血的范圍大小或嚴重程度，也會導致出現(xiàn)不同的行為改變。通過觀察多種相關(guān)行為學指標，可以有效評估腦缺血動物模型是否構(gòu)建成功，以便對相關(guān)作用機制或治療效果進行判斷［66］。下文對腦缺血模型研究中幾種很常用的感覺運動相關(guān)行為范式進行簡要介紹。

4.1 轉(zhuǎn)棒實驗（rotarod test）

轉(zhuǎn)棒實驗最早由Dunham等于1957年建立，此后常被用來評估嚙齒類動物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)模型中的感覺運動協(xié)調(diào)能力和運動學習能力［66］。在此實驗訓練過程中，可以讓受試動物先在靜止的桿上熟悉設備，再在低速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)棒上學習平衡。正式測試時，將受試動物放置在旋轉(zhuǎn)桿上，旋轉(zhuǎn)速度恒定或加速度穩(wěn)定，然后記錄動物下落潛伏期。

4.2 膠帶去除實驗（adhesive tape removal test）

膠帶去除實驗最早由Schallert等建立，用來評估實驗大鼠和小鼠的軀體感覺和運動能力［67］。實驗時，先在動物身體的不同部位（例如前肢、后肢或鼻子）兩側(cè)放置膠帶條，然后通過測量動物感覺及除去此膠帶條所需要的時間來評估動物的表現(xiàn)。此實驗由于操作相對簡單，并能很好地客觀評估相關(guān)能力，因此被長期廣泛運用于嚙齒類腦缺血模型［11］。

4.3 改良神經(jīng)癥狀評估（modified neurological severity score，mNSS）實驗

此實驗常被用來在動物腦缺血發(fā)生后的不同時間點，衡量神經(jīng)功能損傷的程度。根據(jù)薈萃統(tǒng)計結(jié)果顯示，mNSS是在細胞治療相關(guān)腦卒中研究中使用最多的行為范式之一［66］。mNSS可以通過簡單的觀察，對動物的運動、反射和平衡能力進行綜合測試。測試時，可以先把神經(jīng)功能狀態(tài)進行一個等級劃分，然后根據(jù)所觀察到的動物行為狀況給動物進行評估打分。例如，整個狀態(tài)被分為0～14分，行為表現(xiàn)一切正常時定為0分，然后將缺陷行為表現(xiàn)按不同情況劃分為14種，每種缺陷表現(xiàn)代表1分，包括前肢不能彎曲、頭部不能在30 s內(nèi)向縱軸轉(zhuǎn)動至少10°、向癱瘓側(cè)盤旋、無法直線行走、耳廓反射消失、角膜反射消失、無法在橫木上保持平衡等，其中最嚴重的缺陷在此例中累積表現(xiàn)值為14分［68］。

4.4 圓筒實驗（cylinder test）

由于腦損傷動物會更傾向于用非損傷側(cè)控制的肢體，因此利用圓筒實驗可以評價中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型嚙齒類動物的運動不對稱性，也可以用來評估化學物質(zhì)對動物運動性能的療效。例如，實驗時將動物放在一個開放的、透明圓柱體容器內(nèi)，然后將它靠著容器壁站立時的前肢活動記錄下來。前肢活動可以包括損傷同側(cè)肢體活動、損傷對側(cè)肢體活動及兩側(cè)肢體同時活動。前肢接觸容器壁得分，然后計算各自活動接觸總數(shù)的百分比［69］。

4.5 網(wǎng)格爬行實驗（grid walking test）

此實驗也是一種腦損傷動物模型常用的行為范式，它可以用來對動物的肢體自主運動能力進行評估［66，70］。在實驗中，動物被放在正常角度或傾斜角度放置的金屬絲網(wǎng)上，然后計算動物在高架網(wǎng)格上移動時一定時間內(nèi)的配對總步數(shù)（放置兩個前肢），以及動物將損傷側(cè)控制的前肢放錯位置導致其穿過網(wǎng)格的足部障礙錯誤總數(shù)。無損傷動物的足部錯誤通常接近于零。

5 腦缺血動物模型相關(guān)組織學評估

腦缺血發(fā)生后，除了對個體行為表現(xiàn)進行評估，組織學水平上的變化觀察也是評估建模損傷嚴重程度、衡量療效、研究相關(guān)作用機制的重要指標之一。并且，這些組織學變化可以體現(xiàn)在多個方面，例如損傷面積、膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的數(shù)量或新生神經(jīng)元發(fā)生的出現(xiàn)等。下面對建模損傷面積及一些特定細胞類型相關(guān)的組織學評估進行簡要介紹。

5.1 損傷區(qū)域的測量

在腦缺血動物造模后，通常需要對腦部損傷部位及大小進行測量和評估。Nissl染色是最常用的手段之一。一般是用焦油紫（cresyl violet）染料對腦切片進行染色；在損傷急性期觀察損傷范圍時，通常用2，3，5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）進行染色［12，71］。

Nissl染色法是利用神經(jīng)元中的尼氏小體嗜堿性的特點，染色后可以很好觀察腦部的細胞學結(jié)構(gòu)；但在缺血的早期階段，此法無法很好地顯示腦部損傷。

雖然早有研究顯示TTC染色存在一定誤差，不能完全正確地反映腦缺血后損傷嚴重的細胞數(shù)量或面積，但是此方法由于快速、直觀且成本低而被較多使用。有研究觀察顯示，TTC染色在建模1 h后就能清晰標記出腦缺血損傷部位［71］。所以，TTC染色仍然是急性期最常用的腦缺血模型組織損傷范圍測量的首選方法。無色的TTC溶液經(jīng)過組織細胞線粒體中的脫氫酶作用，產(chǎn)生紅色產(chǎn)物，即正常的腦組織呈現(xiàn)紅色，而損傷或壞死的組織部位細胞中，由于無法發(fā)生類似酶促反應而呈現(xiàn)白色。TTC染色時可以先在體灌注TTC染液，再取腦組織切片后觀察；也可先取腦組織，切片后再進行離體TTC染色觀察。值得注意是，有研究顯示這2種處理方法在一些觀察點，例如腦缺血24 h后在體灌注TTC所能觀察到的腦損傷體積顯著大于離體TTC染色［71］。另外，腦缺血后的組織細胞會因為損傷呈現(xiàn)一定的動態(tài)變化。例如，有研究顯示光化學誘導建模后2 d，腦皮層損傷面積可擴大至最大，然后逐漸縮小［9］。另有研究顯示，利用類似的光化學誘導建模，腦部海馬或杏仁核的損傷面積在誘導后第一天達到最大［72］。因此，在同一研究中的某些環(huán)節(jié)，即使都采用TTC染色法，其執(zhí)行觀察的時間及方法細節(jié)都要盡量保持一致，以減少實驗誤差。

5.2 相關(guān)膠質(zhì)細胞及新生細胞發(fā)生的觀察

膠質(zhì)細胞（包括小膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞）是神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成細胞，在正常腦中起著支撐結(jié)構(gòu)、參與突觸傳遞等功能，而在非健康腦中則與神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病發(fā)生等機制密切相關(guān)［73］。眾多研究顯示，腦組織缺血發(fā)生后，膠質(zhì)細胞在受損組織周圍的數(shù)量會顯著升高，其數(shù)量或作用也會隨時間的推移而出現(xiàn)改變［74］。因此，膠質(zhì)細胞數(shù)量及功能的觀察也是評估建模損傷嚴重程度、觀察療效及相關(guān)作用機制研究的重要組成部分。

靜止的星形膠質(zhì)細胞會在腦部缺血損傷發(fā)生后的一定時間（1～2 d）內(nèi)轉(zhuǎn)化為反應性星形膠質(zhì)細胞，后者的增殖能力強，并在損傷區(qū)的膠質(zhì)瘢痕中出現(xiàn)GFAP的高表達［75］。這些星形膠質(zhì)細胞在其中的作用具有雙面性，例如，在前期可以產(chǎn)生多種不良炎性因子及自由基等作用，對機體造成危害［76］；之后又因為能逐漸升高神經(jīng)保護因子如轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）的表達，或出現(xiàn)對損傷細胞碎片有吞噬性等表現(xiàn)，而呈現(xiàn)一定的組織保護性［77］。

腦部缺血后，損傷區(qū)域的小膠質(zhì)細胞很快被激活，然后快速增殖而數(shù)量大增［78］。在有些腦缺血模型動物中，缺血30 min就可以觀察到腦中激活的小膠質(zhì)細胞［78］。類似星形膠質(zhì)細胞，這些激活的小膠質(zhì)細胞在腦缺血損傷過程中也同樣具有雙面性，例如，其能在急性期分泌腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β等炎性因子，或刺激星形膠質(zhì)細胞分泌IL-1α和TNFα等不良炎性細胞因子，進一步對腦部組織造成傷害；也能在一定階段分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子等，以實現(xiàn)一定的保護及修復作用［73］。少突膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中形成髓鞘，中風會導致少突膠質(zhì)細胞出現(xiàn)嚴重損傷。有研究結(jié)果顯示，在大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型中，少突膠質(zhì)細胞數(shù)量減少發(fā)生在損傷后的第5～21天，也就是發(fā)生在神經(jīng)元損傷之后；但研究同時顯示，它在機體自我修復過程中可能也有重要作用［79］。

由于腦缺血后最直接的不良結(jié)果是腦組織細胞的壞死及相應功能的減弱或丟失，過去的研究往往集中在探究如何減少損傷。以前的觀點認為，與其他器官不同，成年腦中沒有神經(jīng)元新生，因此神經(jīng)元缺失后無法補充。但近年大量研究表明，室管膜下層（sub-ventricular zone，SVZ）和海馬顆粒細胞區(qū)（sub-granule zone，SGZ）存在新生神經(jīng)元發(fā)生［80］。基于干細胞領(lǐng)域的研究進展，尤其是膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化的新發(fā)現(xiàn)，人們開始探索受損腦組織是否有神經(jīng)元的新產(chǎn)生，新生的神經(jīng)元功能是否良好，以及是否具有原來部位神經(jīng)元的特性。已有很多研究顯示，腦缺血損傷發(fā)生后，腦部存在新生神經(jīng)元發(fā)生的情況［81］。例如，星形膠質(zhì)細胞一直被認為是腦缺血損傷后新生神經(jīng)元發(fā)生的主要潛在細胞來源［75］，結(jié)合新生神經(jīng)元標志物DCX、增殖細胞標志物5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2'-deoxyuridine，BrdU），在光化學損傷模型小鼠紋狀體損傷區(qū)可以觀察到GFAP+/BrdU+細胞及DCX+/BrdU+細胞顯著增多［12］。然而，在腦缺血區(qū)域的新生神經(jīng)細胞是否是由原損傷部位產(chǎn)生，一直存在爭議。因為有研究顯示，在紋狀體損傷的MCAO模型中，雖然BrdU+陽性細胞數(shù)量在損傷區(qū)顯著增加，但這些新生神經(jīng)元實際上是從SVZ遷移而來［82］。此外，對于損傷區(qū)域出現(xiàn)的新生神經(jīng)元是否真正具有神經(jīng)元的正常生理或功能特性，則要根據(jù)其具體對應的細胞類型來做相應的檢測和驗證。

6 總結(jié)與展望

隨著科學技術(shù)的發(fā)展，目前已有越來越多的方法被應用于腦缺血動物模型的制備?，F(xiàn)今已發(fā)展出許多成熟的腦缺血動物模型，每種模型都有其優(yōu)點和局限性。這些模型主要用于研究腦缺血性疾病的發(fā)病機制、具有神經(jīng)保護作用的分子機制，以及抗腦缺血性藥物的研發(fā)等。

腦缺血動物模型的制備為人類腦缺血性疾病的研究帶來了許多便利。研究人員可以選擇合適的動物模型，并通過控制動物的生理狀況和環(huán)境等變量，嚴格確定損傷部位，從而在最大程度上模擬臨床上相應的腦缺血性疾病。然而，同種模型在不同品系動物的應用上也存在差異［48］，目前尚沒有一個完整的評估體系以供選擇和參考。此外，現(xiàn)有的全腦缺血模型均以機械閉塞血管為主，會對動物生理狀況造成嚴重影響，與人類全腦缺血的發(fā)病機制相比差異較大，不適于康復研究。為此，可借鑒局灶性缺血模型中的給藥方法來開創(chuàng)新型動物模型，以滿足實際研究中的需要。

盡管局灶性缺血動物模型的發(fā)展相對更為成熟，但近年來的研究中仍以短暫性大腦中動脈閉塞建模為主，而這一模型只符合2.5%～11.3%的腦卒中患者［83］。為此，后續(xù)研究應突出永久性閉塞大腦中動脈的重要地位，為臨床上治療腦卒中提供更為精準的研究模型。上述模型中部分可在造模中直接觀察到阻斷血流或再灌注的發(fā)生，但很多情形下缺乏這樣的證據(jù)。如果將一些造模不成功的動物納入實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析中，還會造成實驗結(jié)果重復性低，甚至出現(xiàn)相互矛盾的研究報告。一個建議的方法是，采用血流監(jiān)測設備在造模中動態(tài)觀察血流的改變，盡量確保造模動物在同一實驗條件下表現(xiàn)出類似的損傷范圍和病理改變，并結(jié)合之后的行為學及組織學等評估，盡可能最大程度地保障在建模穩(wěn)定的基礎上，對療效及相關(guān)作用機制進行客觀正確的觀測。

相信隨著研究的不斷深入，不同腦缺血動物模型的局限性會逐漸得以解決，符合不同類型腦缺血性疾病的動物模型也會日益完善，以促使基礎研究成果更好地轉(zhuǎn)化為臨床應用。