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        異丙酚對熱損傷小鼠氧化應(yīng)激損傷的保護效應(yīng)探究

        2021-09-18 09:06:26陳石生
        實用中西醫(yī)結(jié)合臨床 2021年14期
        關(guān)鍵詞:脂肪乳異丙酚孵育

        陳石生

        (南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院太和分院內(nèi)科 廣東廣州510540)

        中暑屬于急性熱致疾病,表現(xiàn)為中心體溫迅速升高至40℃以上,伴有中暑神經(jīng)功能障礙,嚴(yán)重時可引起多臟器功能障礙綜合征(MODS),具有較高的致殘率、病死率[1]。高熱可造成人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),增加細胞內(nèi)活性氧(ROS)生成,介導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷,引起細胞毒性改變,誘發(fā)細胞凋亡[2~3]。異丙酚是一種短效、快速的鎮(zhèn)靜藥,具有不良反應(yīng)少、易喚醒、起效快等優(yōu)點,同時可抑制細胞內(nèi)ROS生成,減輕細胞損害[4]。但異丙酚是否能夠有效改善熱損傷所致的氧化應(yīng)激損傷研究較少。本研究分析異丙酚對熱損傷小鼠氧化應(yīng)激損傷的保護效應(yīng),為臨床治療提供新思路?,F(xiàn)報道如下:

        1 資料與方法

        1.1 主要試劑與儀器Gibco公司的胎牛血清(FBS)、胰酶、雙抗;購自ThermoScientificTM公司的ROS、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒;Caspase活性檢測試劑盒(Biovision公司);英國Astra Zeneca公司提供的異丙酚;流式細胞儀(美國BD公司);脂肪乳購自輔仁藥業(yè)集團有限公司;酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)。

        1.2 實驗動物SPF級BALB/c小鼠,雄性,6~8周齡,體質(zhì)量25~30 g,購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,許可證號:SCXK(粵)2011-0015。1.3模型制作與分組 按隨機數(shù)字表法將BALB/c小鼠分為37℃組、37℃+異丙酚組、37℃+脂肪乳組、43℃組、H2O2+異丙酚組、43℃+異丙酚組6組,每組10只。HUVECs鋪入細胞培養(yǎng)皿內(nèi),密度1.0×105/ml,置入43℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)實施2 h熱打擊,隨后以5%CO2、37℃常規(guī)培養(yǎng)6 h,創(chuàng)建HUVECs熱打擊模型。37℃+脂肪乳組:在含10%脂肪乳培養(yǎng)基內(nèi)置入細胞,時間為6 h;37℃+異丙酚組:在含50 μM異丙酚培養(yǎng)基內(nèi)置入細胞,時間為6 h;43℃+異丙酚組:在含50 μM異丙酚培養(yǎng)基內(nèi)置入細胞,時間為6 h,隨后實施熱打擊;H2O2+異丙酚組:細胞先用200 μM H2O2預(yù)處理,再置入含50 μM異丙酚培養(yǎng)基內(nèi)置入細胞,時間為6 h。

        1.4 細胞活力檢測 用WST-1法檢測,各組處理后放置在孵育箱(37℃)內(nèi)培養(yǎng)6 h,分別在96孔板的每孔內(nèi)加入約10 μl WST-1,置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。用酶聯(lián)免疫檢測儀讀取450 nm處的OD值,判斷細胞活力。

        1.5 ROS檢測 用熒光探針法測定主動脈內(nèi)皮ROS表達。按照試劑盒處理主動脈內(nèi)皮組織,均漿,冷PBS重懸,加入適量熒光探針DHE,37℃、避光孵育30 min,細胞內(nèi)ROS變化用流式細胞儀測定,激發(fā)、發(fā)射波長分別為353 nm、515 nm。

        1.6 ATP含量檢測 用熒光素-熒光素酶法,將對數(shù)生長期HUVECs鋪入96孔板,每孔5×103,細胞貼壁穩(wěn)定后進行上述分組處理,為獲得背景數(shù)值,另準(zhǔn)備對照孔,只含HPSS液,不含細胞。每孔內(nèi)加入與細胞懸液等體積的熒光素酶試劑,室溫避光,孵育10 min,穩(wěn)定熒光,用多光譜微孔板閱讀器分析熒光強度。

        1.7 Caspase活性檢測 取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的HUVECs實施分組處理,收集細胞,PBS沖洗,重復(fù)3次,滴加50 μl細胞裂解液,4℃下作用10 min,對樣品裂解,以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心操作1 min,取上清液。分別在每個細胞樣品內(nèi)加入Caspase底物Ac-DEVD-AMC,37℃下孵育2 h,對Caspase-3/9活性檢測。用酶標(biāo)儀讀取405 nm的OD值。

        1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件分析數(shù)據(jù),用(±s)表示計量資料,多組間比較用單因素方差分析,兩組間比較用SNK-q檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組細胞活力對比37℃各組細胞活力對比,無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),43℃組細胞活力低于37℃組,且H2O2+異丙酚組、43℃+異丙酚組細胞活力高于43℃組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

        圖1 各組細胞活力對比

        2.2 各組細胞內(nèi)ROS情況對比37℃各組細胞內(nèi)ROS含量對比,無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);43℃組細胞內(nèi)ROS含量高于37℃組,H2O2+異丙酚組、43℃+異丙酚組細胞內(nèi)ROS含量低于43℃組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

        圖2 各組細胞內(nèi)ROS情況對比

        2.3 各組細胞內(nèi)ATP情況對比37℃各組細胞內(nèi)ATP含量對比,無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);43℃組細胞內(nèi)ROS含量低于37℃組,43℃+異丙酚組、H2O2+異丙酚組細胞內(nèi)ATP含量高于43℃組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

        圖3 各組細胞內(nèi)ATP情況對比

        2.4 各組細胞Caspase-3、Caspase-9活性情況對比37℃各組細胞內(nèi)Caspase活性對比,無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);43℃組細胞 內(nèi)Caspase-3/9活性高于37℃組,43℃+異丙酚組、H2O2+異丙酚組細胞內(nèi)Caspase-3/9活性低于43℃組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

        圖4 各組細胞Caspase-3、Caspase-9活性情況對比

        3 討論

        中暑的病理生理學(xué)反應(yīng)除熱暴露直接損傷外,繼發(fā)于熱損傷后全身炎癥反應(yīng)綜合征更為關(guān)鍵,能進展為“類膿毒癥”反應(yīng),誘發(fā)MODS過程[5]。在早期熱損傷中血管內(nèi)皮細胞(VECs)占有重要地位,既是熱損傷效應(yīng)器官,可覆蓋于全身器官血管內(nèi)皮和循環(huán)系統(tǒng),又是熱損傷的放大器官,其損傷能夠引起凝血激活、炎癥放大,損傷各種器官功能[6~7]。另外,VECs會減少內(nèi)皮表面糖包和內(nèi)皮細胞生成活化蛋白C等抗凝成分,增加vWF等促凝成分,促使血小板活化,促進微血栓形成,減少組織灌注,誘發(fā)臟器功能障礙,并會造成內(nèi)皮損害加重,形成惡性循環(huán),最終誘發(fā)MODS。

        ROS是中暑過程中VECs損傷的重要方式之一,熱損傷早期會損傷細胞DNA,增加細胞內(nèi)ROS爆發(fā)性,損傷線粒體,造成細胞死亡。使用ROS特異性抑制劑能夠使細胞內(nèi)ROS水平,逆轉(zhuǎn)熱損傷所致的細胞損傷[8]。本研究結(jié)果提示在熱損傷過程中,異丙酚可發(fā)揮抗凋亡、抗氧化損傷、保護線粒體作用。異丙酚起效迅速,用藥后可迅速穿過細胞膜,廣泛分布至全身各器官組織內(nèi),可使自由基對ATP的損傷減輕,抑制鈣超載,有助于線粒體呼吸功能改善,還能影響線粒體脂質(zhì)過氧化過程,防止線粒體內(nèi)膜流動性改變、通透性增高,對線粒體膜結(jié)構(gòu)形成保護[9~10]。異丙酚可使熱損傷引起的內(nèi)皮細胞氧化損傷減輕,增加內(nèi)皮細胞線粒體膜電位、MPTP穩(wěn)定性,提高細胞內(nèi)ATP水平,對Caspase介導(dǎo)的線粒體凋亡通絡(luò)形成抑制,阻礙其活化,進而改善內(nèi)皮細胞線粒體功能。另外,異丙酚還能經(jīng)抑制中性粒細胞呼吸爆發(fā)、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子平衡、減少自由基生成、抑制炎癥介質(zhì)與細胞因子表達等發(fā)揮抗氧化作用。

        綜上所述,在熱損傷過程中,異丙酚可發(fā)揮抗凋亡、抗氧化損傷、保護線粒體作用。

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