楊麗娟，鄧高，陸壯念，李沛隆，梁立婷，羅秀狀，林娜

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，廣西 百色 533000；3. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，廣西 百色 533000)

解整合素-金屬蛋白酶33(a disintegrin and metalloprotese 33，ADAM33)為鋅依賴性金屬蛋白酶ADAM家族的成員之一，屬于1型跨膜酶原糖蛋白，位于染色體20p13.10的短臂上，長(zhǎng)約14 kb，由21個(gè)內(nèi)含子和22個(gè)外顯子組成。其主要生物學(xué)功能包括細(xì)胞活化、蛋白水解、分子修飾和釋放、信號(hào)傳導(dǎo)等[1]。ADAM33主要在平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，并在這些細(xì)胞中發(fā)揮作用，而在炎癥細(xì)胞、上皮細(xì)胞中的表達(dá)較少。研究表明，ADAM33基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病、過(guò)敏性鼻炎等特異性疾病有關(guān)[2-4]，其在氣道重塑及哮喘精準(zhǔn)治療中起著重要的作用[5-6]。本文主要研究ADAM33基因rs511898、rs44707這兩個(gè)位點(diǎn)在廣西壯族兒童中的分布特點(diǎn)并與其他地區(qū)民族或種族進(jìn)行比較，為探討ADAM33基因SNP的生物學(xué)功能及其與某些疾病的相關(guān)性提供更多依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選擇2021年1月—2021年5月在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒童保健科體檢的健康兒童94例，其中男52例，女42例，平均年齡(5.29±2.29)歲，研究對(duì)象直系三代均為廣西壯族人，相互之間無(wú)血緣關(guān)系。以上研究對(duì)象的家屬和(或)監(jiān)護(hù)人均知曉本研究，并自愿簽署知情同意書。此研究已通過(guò)本單位的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1DNA提取 用乙二胺四乙酸抗凝管收集研究對(duì)象外周靜脈血2ml，使用離心柱型血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，在-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì) 由上海捷瑞生物工程有限公司通過(guò)premier 6在線軟件設(shè)計(jì)合成引物，擴(kuò)增rs511898位點(diǎn)和rs44707位點(diǎn)的引物序列，見表1。

表1 擴(kuò)增rs511898位點(diǎn)和rs44707位點(diǎn)的引物序列

1.2.3PCR擴(kuò)增 總反應(yīng)體積為15 μl，其中包含2 X CPR MIX 7.5 μl，正向引物0.3 μl，反向引物0.3 μl，模板DNA 1 μl，雙蒸水5.9 μl。充分混勻，放入PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，按程序94℃ 20 s→ 58℃ 20 s→ 72℃ 40 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)，之后72℃修復(fù)延伸5 min。

1.2.4PCR產(chǎn)物純化 總反應(yīng)體積為7 μl，PCR產(chǎn)物3 μl，核酸外切酶I 0.2 μl，堿性磷酸酶FastAP 0.8 μl，核酸外切酶I buffer緩沖液 0.7 μl，雙蒸餾水2.3 μl，置于37℃水浴鍋15 min → 80℃水浴鍋15 min。

1.2.5延伸反應(yīng) 總反應(yīng)體積為6 μl，PCR純化產(chǎn)物2 μl，SNAPSHOT mix 1 μl，延伸引物(10 μM)0.2微升/條，雙蒸餾水2.8 μl，按程序94℃ 10 s→ 52℃ 5 s→ 60℃ 30 s擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。取1 μl產(chǎn)物，加9 μl上樣HiDi，95℃變性3 min，立即冰水浴，上測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用GeneMarker V 2.2.0軟件對(duì)rs511898位點(diǎn)和rs44707位點(diǎn)進(jìn)行分型分析。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。ADAM33基因型及其等位基因用計(jì)數(shù)法計(jì)算頻率，并進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1廣西壯族兒童ADAM33 rs511898、rs44707位點(diǎn)的基因分型 分型檢測(cè)結(jié)果顯示rs511898存在3種基因型，分別為 CC、CT、TT，基因型峰型，見圖1。rs44707存在3種基因型，分別為GG、GT、TT，基因型峰型，見圖2。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)分析，兩位點(diǎn)基因型均符合Hardy-Weinberg平衡，所選人群群體代表性好(P>0.05)，結(jié)果具有群體代表性。

注：rs511898延伸引物為反向延伸，產(chǎn)物為多態(tài)性的

注：A為GG基因型峰型；B為GT基

2.2廣西壯族兒童ADAM33基因多態(tài)性分布 ADAM33基因rs511898位點(diǎn)在廣西壯族兒童中以CC基因型最常見(52.13%)，C等位基因的頻率最高(71.81%)，男女基因型及等位基因頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。rs44707位點(diǎn)以GT基因型最常見(50.00%)，G等位基因的頻率最高(62.23%)，男女基因型及等位基因頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1 廣西壯族兒童ADAM33基因rs511898位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布

表2 廣西壯族兒童ADAM33基因rs44707位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布

2.3廣西壯族兒童ADAM33基因rs511898位點(diǎn)多態(tài)性與不同地區(qū)種族的比較 rs511898位點(diǎn)的基因型與中國(guó)南方漢族人及美國(guó)哥倫比亞人相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與非洲尼日利亞人、東亞日本人、南亞巴基斯坦人相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，rs511898位點(diǎn)等位基因分布頻率除與中國(guó)南方漢族人差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，與非洲尼日利亞人、東亞日本人、南亞巴基斯坦人及美國(guó)哥倫比亞人相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表3。

表3 廣西壯族兒童 rs511898基因型和等位基因分布頻率與不同地區(qū)種族人群比較

2.4廣西壯族兒童ADAM33基因rs44707位點(diǎn)多態(tài)性與不同地區(qū)種族的比較 廣西壯族兒童ADAM33基因rs44707位點(diǎn)的基因型及等位基因分布頻率與中國(guó)南方漢族人差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與非洲尼日利亞人、東亞日本人、南亞巴基斯坦人及美國(guó)哥倫比亞人相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，rs44707位點(diǎn)等位基因分布頻率除與中國(guó)南方漢族人差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，與非洲尼日利亞人、東亞日本人、南亞巴基斯坦人及美國(guó)哥倫比亞人相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表4。

表4 廣西壯族兒童rs44707基因型和等位基因分布頻率與不同地區(qū)種族人群比較

3 討論

ADAM33已被證實(shí)與氣道重塑有關(guān)，它是由轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β誘導(dǎo)的胞外域脫落而產(chǎn)生的，具有促血管生成作用[7-8]。國(guó)內(nèi)外研究表明，ADAM33與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，Manica等[9]研究證實(shí)了ADAM33蛋白的缺乏或低表達(dá)可能會(huì)增加乳腺癌細(xì)胞的侵略和轉(zhuǎn)移，其發(fā)生機(jī)制尚不明確。Stasikowska-Kanicka O等[10]發(fā)現(xiàn)了ADAM33在鼻竇倒置型乳頭狀瘤和喉鱗狀細(xì)胞癌中過(guò)表達(dá)。張國(guó)華等[11]采用免疫組化染色和甲基化DNA免疫共沉淀-定量PCR法檢測(cè)90例膽管癌患者腫瘤組織和癌旁正常組織中ADAM33蛋白表達(dá)和基因甲基化程度，結(jié)果顯示ADAM33蛋白在膽管癌組織中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)不受ADAM33啟動(dòng)子甲基化調(diào)控的影響，但與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。以上研究表明，ADAM33過(guò)度表達(dá)或低表達(dá)均可增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，部分腫瘤的發(fā)生推測(cè)可能與ADAM33的促血管生成作用有關(guān)。故可將ADAM33作為一種新型分子標(biāo)志物，用于明確某些腫瘤的分型、治療及預(yù)后判斷。Feng HH等[12]通過(guò)薈萃分析探討了ADAM33基因rs511898位點(diǎn)與COPD易感性之間的關(guān)系，結(jié)果顯示ADAM33 基因rs511898位點(diǎn)突變基因A可能增加亞洲人群中COPD的風(fēng)險(xiǎn)。王莎莎等[13]采用SNaPshot SNP分型技術(shù)對(duì)新疆地區(qū)哈薩克族193例對(duì)照組及197例COPD病例組檢測(cè)ADAM33基因各位點(diǎn)多態(tài)性，研究發(fā)現(xiàn)ADAM33基因rs511898多態(tài)性與可能與新疆哈薩克族人群COPD的發(fā)生有關(guān)。Li HF等[14]的薈萃分析亦表明亞洲人群中rs511898多態(tài)性的等位基因和基因型與哮喘易感性有關(guān)。Liang SQ等[15]在按種族進(jìn)行的亞組分析的一項(xiàng)薈萃分析中也提及，ADAM33基因rs511898多態(tài)性僅在亞洲人中發(fā)現(xiàn)了陽(yáng)性結(jié)果，而在歐洲或拉丁美洲則沒(méi)有。由上述研究可推測(cè)ADAM33基因rs511898位點(diǎn)多態(tài)性可能是亞洲人群哮喘及COPD發(fā)病的危險(xiǎn)因素。

本文通過(guò)對(duì)廣西壯族兒童ADAM33基因rs511898和rs44707位點(diǎn)SNP分析，結(jié)果顯示ADAM33基因rs511898和rs44707位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率在男女性別間比較均無(wú)差異，說(shuō)明這2個(gè)位點(diǎn)基因型與等位基因分布可能與性別無(wú)關(guān)。通過(guò)與ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)公布的千人基因組計(jì)劃中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)廣西壯族兒童rs511898位點(diǎn)各基因型及等位基因的分布頻率與非洲尼日利亞人、日本人、南亞巴基斯坦人相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其基因型分布頻率與美國(guó)哥倫比亞人相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而等位基因分布頻率與美國(guó)哥倫比亞人相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；廣西壯族兒童rs44707位點(diǎn)各基因型及等位基因的分布頻率與上述4國(guó)家的人群比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩位點(diǎn)各基因型及等位基因的分布頻率與中國(guó)南方漢人相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明，rs511898和rs44707位點(diǎn)SNP可能與種族和地域存在密切關(guān)系，廣西壯族兒童與中國(guó)南方漢人同屬一個(gè)種族，均生活在南方地帶，親緣關(guān)系較接近，故SNP差異不大，而與非洲尼日利亞人、東亞日本人、南亞巴基斯坦人親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且生活的環(huán)境、地域、飲食、生活習(xí)慣均不同，故SNP差異較大，這亦符合生物多樣性的遺傳進(jìn)化規(guī)律，而這種遺傳進(jìn)化可能導(dǎo)致某些疾病在特定人群或地域中的發(fā)病率增高。對(duì)于rs511898 C/T位點(diǎn)，廣西壯族兒童的基因型與美國(guó)哥倫比亞人比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其等位基因分布頻率與美國(guó)哥倫比亞人相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示等位基因C可能是風(fēng)險(xiǎn)等位基因，這為后續(xù)探討該位點(diǎn)與廣西壯族兒童某些特定疾病的相關(guān)性提供了重要線索。