陳淑霞，林健賢，高歡歡，唐麗娟，張文忻，李永平，張平

(中山大學中山眼科中心，中山大學眼科學國家重點實驗室，廣州 510060)

以往針對臨床送檢的玻璃體液處理多以細胞涂片法和離心直接取細胞沉渣包埋法為主，但在長期實踐中發(fā)現(xiàn)，細胞涂片法會因為涂片厚薄不均而出現(xiàn)細胞堆積重疊、細胞分散、細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不清，有背景染色等情況，造成閱片及診斷上的困難；離心直接取細胞沉渣包埋法對標本量的要求比較大，適用于送檢量多且離心后肉眼可見細胞沉淀多的玻璃體切割液，不適合送檢量少或細胞量少的玻璃體液。隨著臨床對病理診斷要求的不斷提高[1-2]，將玻璃體液中的微量細胞沉淀制成細胞塊的技術(shù)運用十分關(guān)鍵，它在細胞學研究與病理的診斷中起非常重要的作用[3-4]：不僅能為細胞學診斷提供更加完整的信息和清晰的形態(tài)結(jié)構(gòu)，還可用于免疫組織化學染色，特殊染色等輔助檢測手段。本研究收集25例玻璃體液(包括玻璃體切割液)為研究對象，探討改良型細胞蠟塊的制作及染色在玻璃體液病理診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源

收集2020年9月至2021年1月臨床送檢至中山大學中山眼科中心臨床病理科的玻璃體液(含玻璃體切割液)25例。

1.1.2 儀器與試劑

低速離心機購自上海安亭科學儀器廠，干式恒溫器購自昆明東環(huán)科技有限公司，全自動密閉式組織脫水機購自德國Leica公司，細胞塊制備試劑盒購自昆明東環(huán)科技有限公司。

1.2 方法

標本處理前，打開干式恒溫器進行預熱，并將細胞塊制備試劑盒中配備的專用離心管置于干式恒溫器上(圖1)，使專用離心管中的基質(zhì)加熱熔化，保持在85 ℃?zhèn)溆?。接著處理標本及制作細胞塊：1)將臨床送檢的玻璃體液轉(zhuǎn)移至5 mL的離心管中，2000 r/min離心5 min；玻璃體切割液(混有組織塊時，需將組織塊取出單獨包埋)則分批轉(zhuǎn)移至50 mL的離心管中，2000 r/min離心5 min，吸去上清液，合并所有離心管的微量細胞沉渣，再次離心。2)離心完成后，用吸管吸去上清液，離心管內(nèi)留下細胞沉淀(此時混勻后涂片一張用于做對照)。3)之后加入5倍以上體積的細胞固定液，用吸管將細胞沉淀輕輕吹打成分散的細胞或細胞團，預固定10 min。4)取出事先在干式恒溫器上預熱的專用離心管，基質(zhì)完全液化后，打開紅色離心管蓋，將預固定的細胞固定液混懸液加入專用離心管中，用吸管反復吹打使細胞混懸液和基質(zhì)充分混勻。加樣量：直徑8 mm專用離心管，加樣量約1000 μL；直徑4 mm專用離心管，加樣量約400 μL。5)趁熱立即離心，將離心管頭透明端向下，1500 r/min離心5 min。離心完成后，將專用離心管置于4 ℃冰箱10 min以上，使基質(zhì)充分凝固。6)取材：打開兩端離心管蓋，撕去密封膜，用棉簽將含有細胞的基質(zhì)推出離心管，用刀片切下3 mm厚細胞端，最下層細胞向下放入塑料包埋盒中(最下層細胞含有細胞團和大細胞)。7)將制成的細胞塊在全封閉組織脫水機中進行脫水，透明與浸蠟，用石蠟包埋機制備成細胞蠟塊，常規(guī)切片并行HE染色，必要時進行免疫組織化學染色及特殊染色。

圖1 專用離心管置于干式恒溫器上加熱熔化Figure 1 Special centrifugal tube is heated in a dry thermostat

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察

經(jīng)過上述過程制作而成的細胞塊是呈果凍樣的圓柱膠體，經(jīng)處理后制備成蠟塊(圖2)，肉眼可見細胞塊與蠟融合良好，兩者之間未見裂隙。細胞蠟塊硬度好，包埋面形狀規(guī)則，切片完整(圖3)。

2.2 顯微鏡下觀察

與傳統(tǒng)涂片法對比，傳統(tǒng)涂片法制片后HE染色可見細胞成堆分布不均勻，細胞堆疊嚴重，結(jié)構(gòu)欠清晰，難以區(qū)分細胞形態(tài)(圖4)。應用試劑盒制備的細胞蠟塊制片后進行HE 染色，效果好(圖5，6)，細胞數(shù)量分布適中，細胞之間分散且均勻平鋪，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，細胞核和細胞質(zhì)著色良好，連續(xù)切片中細胞成分分布均勻，背景干凈。

3 討論

玻璃體液細胞蠟塊制備是細胞學檢查重要的組成部分，是對細胞涂片診斷的有力補充，能滿足免疫組織化學染色和特殊染色檢測的需要，為提高細胞學診斷的正確性提供更多診斷依據(jù)[5-7]。目前針對細胞塊的制作技術(shù)并沒有統(tǒng)一標準，在不同病理科及實驗室所用的細胞塊制備技術(shù)不盡相同。本科室接收的玻璃體液標本，根據(jù)切割液中細胞含量選擇直接離心取細胞沉渣包埋法或細胞塊制備試劑盒法。離心取細胞沉渣包埋法制備細胞蠟塊雖然是較為簡單的方法，但適用于送檢量大且細胞沉淀多的玻璃體切割液，離心后沉淀物聚集不易分散；對于送檢量少或細胞量比較少的玻璃體液用此法制作細胞蠟塊制片后效果不佳，究其原因，離心沉渣法是直接取離心后的沉渣物進行固定脫水包埋，由于沉渣物量少且細胞中間缺乏一定的支架，離心時細胞難以聚集成團，且在利用吸管將離心管底部的微量沉渣轉(zhuǎn)移至包埋紙的過程中，沉渣碎裂，吸管及離心管附著較多細胞，脫水后包埋紙中仍貼附有部分細胞[8]，導致最后細胞的富集效果不理想，從而影響制片與診斷。

細胞塊制備試劑盒法直接彌補了離心取細胞沉渣包埋法的不足之處，能將送檢量少細胞量少的玻璃體液制作成細胞蠟塊，防止細胞丟失。此方法中的關(guān)鍵基質(zhì)材料與瓊脂糖作用相似，首先將專用離心管加熱使基質(zhì)液化，用液態(tài)基質(zhì)作為分離富集的介質(zhì)材料，降低溫度后，冷卻凝固的固態(tài)基質(zhì)作為支架材料，將在液態(tài)條件下分離富集的細胞、細胞團，支撐凝固在特定的空間位置。瓊脂糖包埋法是文獻[8-9]報道中使用較多的方法，但由于該方法存在需現(xiàn)配瓊脂、溫度和濃度不易掌握，操作步驟繁瑣，操作過程受人為的影響因素大等缺點，沒有在玻璃體液細胞學檢查中進行廣泛應用。而細胞塊制備試劑盒法操作步驟簡單，通過溫度和時間的可控，最大限度地避免人為操作帶來的誤差，提高標本制片滿意率。另外，試劑盒中配有兩種不同內(nèi)徑的專用離心管，當送檢的玻璃體液沉渣物較多時，可選擇內(nèi)徑8 mm的專用離心管進行制備細胞塊。當送檢的玻璃體液沉渣物較少時，使用小內(nèi)徑的專用離心管能夠?qū)⑽⑿吮揪奂谱鞒杉毎麎K。

采用細胞塊制備試劑盒技術(shù)制作的細胞蠟塊，有如下優(yōu)點：可對微量標本進行處理，提高利用率；制備的細胞塊完整，基質(zhì)與石蠟之間無裂痕；細胞塊切片順暢，滿足標本連續(xù)切片，為免疫組織化學染色、特殊染色等檢測提供豐富的切片，有利于后續(xù)的診斷和研究；并可永久保存標本。但應用過程中應該注意以下幾點：1)當送檢的玻璃體液離心后沉渣物肉眼不易觀察時，應適當提高離心機轉(zhuǎn)數(shù)或多次離心富集，直至滿足要求。2)若送檢的眼內(nèi)液體外觀是紅色或深紅色，則需要向細胞沉渣物中加入5倍以上的紅細胞裂解工作液，消除大量紅細胞造成的背景干擾，有利于提高腫瘤細胞或炎癥細胞等的檢出率。3)用小吸管輕柔地將細胞混懸液與基質(zhì)充分混勻后，應該立即趁熱離心。此步驟需快速完成，否則溫度降低，細胞與基質(zhì)凝膠體沒有離心便先形成凝固，影響細胞的分離富集效果。4)待基質(zhì)凝膠體凝固后，用棉簽推出，棉絮輕軟，有利于保護細胞不受擠壓、基質(zhì)凝膠體不易破碎等。5)由于細胞是有序分布，大細胞，高核質(zhì)比細胞，細胞團在最下層，因此必須將細胞塊的最下端作為包埋面，包埋時應輕夾輕放，切片時應輕修少修，以免造成細胞的損失。6)試劑盒制備的細胞蠟塊制片做免疫組織化學染色前，烤片時間適當加長、溫度設(shè)為65 ℃以上，使細胞有效黏附于玻片上，防止脫片。

綜上所述，應用細胞塊制備試劑盒處理眼內(nèi)玻璃體液的操作過程簡單方便，可連續(xù)切片，不僅滿足常規(guī)病理診斷的需求，還可用于后續(xù)免疫組織化學染色和特殊染色的檢測，為臨床提供了有價值的細胞學診斷結(jié)果。