梅霄陽(yáng)，閆林軒，李 麗，王勤章，李應(yīng)龍

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832000；3.成都市第五人民醫(yī)院，四川 成都 610000)

缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury，IRI)是指由多種原因引起的組織或器官缺血以及血流灌注恢復(fù)造成損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象。腎臟作為高灌注器官對(duì)IRI較敏感，臨床上常見(jiàn)于腎移植、部分腎切除術(shù)等過(guò)程中[1-2]。腎缺血再灌注損傷是缺血性急性腎損傷的重要損傷環(huán)節(jié)，盡管目前治療技術(shù)有了明顯進(jìn)步，如血液凈化、選擇性動(dòng)脈阻斷等技術(shù)的開(kāi)展，但是休克、膿毒癥等造成的急性腎損傷仍嚴(yán)重威脅著患者的生命安全。不僅影響移植腎早期功能恢復(fù)及長(zhǎng)期存活，而且病死率較高[3]，但是阻斷血流的腎部切除手術(shù)仍然是泌尿外科治療腎腫瘤的主要手段。腎缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制十分復(fù)雜，如何減輕缺血再灌注過(guò)程帶來(lái)的組織器官損害成為目前臨床工作亟需解決的難題。低氧預(yù)適應(yīng)(Hypoxic preconditioning，HPC)和遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)(Remote ischemic preconditioning，RIPC)作為一種新穎的預(yù)處理方法成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，其在多個(gè)器官如骨骼肌、腎、肝表現(xiàn)出對(duì)IRI的保護(hù)作用[4-7]。HPC指預(yù)先低劑量非致死性短時(shí)間重復(fù)低氧處理，誘發(fā)機(jī)體獲得對(duì)隨后急性致死性損傷的耐受能力。RIPC即預(yù)先在遠(yuǎn)離缺血臟器的其他組織或器官實(shí)施短時(shí)間缺血再灌注處理增加對(duì)長(zhǎng)時(shí)間缺血的抵抗力的過(guò)程。然而，低氧聯(lián)合遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)腎缺血再灌注損傷是否存在協(xié)同保護(hù)作用及其機(jī)制，目前尚缺乏相關(guān)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1主要儀器及試劑：TUNEL試劑盒(武漢博士德生物過(guò)程有限公司)；Bcl-2兔多克隆抗體、Caspase3兔多克隆抗體(Abcam公司)，APY-250IM恒溫恒濕低氧艙(杭州得聚儀器設(shè)備有限公司)；醫(yī)用彈力繃帶；正置熒光顯微鏡(Olympus)。

1.2研究方法

1.2.1腎臟IRI模型制備：參考本實(shí)驗(yàn)室既往方法，實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前禁食6 h，以3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉成功后，將其俯臥位固定，常規(guī)手術(shù)區(qū)消毒、鋪巾，暴露并游離腎臟，切除右側(cè)腎臟，分離左側(cè)腎動(dòng)脈，無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉腎動(dòng)脈，避免損傷周圍大血管及輸尿管，觀察腎臟由鮮紅色逐漸變?yōu)榘导t色，說(shuō)明缺血成功，反之缺血失敗。持續(xù)缺血45 min，恢復(fù)血流，再灌注24 h。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：選擇健康清潔級(jí)SD雄性大鼠40只，體重250～300 g之間，周齡12周左右，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)SPF級(jí)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)本院動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。隨機(jī)均分五組，假手術(shù)組，切除右腎，僅暴露左腎；缺血再灌注組，低氧預(yù)適應(yīng)組，缺血再灌注前將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于恒溫恒濕低氧艙內(nèi)，正常光照，充入氮氧混合氣體，將氧濃度維持在12%，15 h/d(17∶00～8∶00)，持續(xù)4周；遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)組，缺血再灌注前24 h用醫(yī)用彈力繃帶施加對(duì)左下肢圓形壓縮的10 min缺血和10 min再灌注3個(gè)循環(huán)；低氧預(yù)適應(yīng)聯(lián)合遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)組，缺血再灌注模型制備前24 h，先進(jìn)行低氧預(yù)適應(yīng)，再進(jìn)行對(duì)左下肢的10 min缺血和10 min再灌注3個(gè)循環(huán)。

1.2.3組織處理與標(biāo)本采集：各組大鼠造模過(guò)程中如出現(xiàn)死亡，以同等方法補(bǔ)充。所有動(dòng)物造模實(shí)驗(yàn)前6 h禁食，允許自由飲水。再灌注24 h后，進(jìn)行組織處理及標(biāo)本采集，戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，行下腔靜脈采血，取血后打開(kāi)胸腔，用冰鹽水經(jīng)左心室反復(fù)灌洗腎臟至顏色蒼白，取出左側(cè)腎臟，去除被膜，行縱軸冠狀面剖開(kāi)，置于4%多聚甲醛固定48 h。

1.2.4腎功能血生化檢測(cè)：采集的大鼠血標(biāo)本，離心后取上清液送往石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)水平。

1.2.5腎組織病理學(xué)檢查：取出多聚甲醛固定的腎組織，脫水透明，石蠟包埋，切片后行HE染色，200倍光鏡下觀察病理形態(tài)并攝片，進(jìn)行Paller評(píng)分[8]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：腎小管擴(kuò)張明顯計(jì)1分；腎小管上皮細(xì)胞腫脹或扁平1分；刷狀緣損傷1分；刷狀緣脫落2分；管型形成2分；腎小管管腔存在脫落、壞死(尚未形成管型或細(xì)胞碎片)1分；腎小管正常0分。由專業(yè)的病理醫(yī)師每個(gè)視野隨機(jī)選擇10個(gè)腎小管，參照評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估損傷程度。

1.2.6TUNEL法檢測(cè)腎細(xì)胞凋亡：TUNEL染色后，400倍熒光顯微鏡下觀察，每張片子隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的視野拍照，陽(yáng)性細(xì)胞為綠色熒光，采用ImageProPlus6.0圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)各類細(xì)胞數(shù)，取其平均值計(jì)算凋亡指數(shù)。細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.7免疫組化檢測(cè)腎組織caspase3和bcl-2蛋白表達(dá)：取石蠟切片，嚴(yán)格參照試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟操作，免疫組化染色后，陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，于400倍光鏡下觀察切片，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，應(yīng)用顯微成像系統(tǒng)采集圖像，并采用ImageProPlus6.0對(duì)圖像進(jìn)行半定量分析，計(jì)算各組caspase3和bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值(IOD/Area)。

2 結(jié)果

2.1腎功能血生化檢測(cè)結(jié)果：缺血再灌注組、低氧預(yù)適應(yīng)組、遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)組及低氧聯(lián)合遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)組血清BUN和Scr水平均較假手術(shù)組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與缺血再灌注組比較，低氧預(yù)適應(yīng)組、遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)組及聯(lián)合組BUN和Scr水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與低氧預(yù)適應(yīng)或遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)組比較，聯(lián)合組對(duì)腎功能水平改善更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血生化BUN和Scr水平

2.2腎組織病理改變：HE染色后光鏡下可見(jiàn)假手術(shù)組結(jié)果清晰，無(wú)明顯異常，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，刷狀緣完好，管腔未見(jiàn)管型及管腔堵塞。缺血再灌注組組織結(jié)構(gòu)明顯紊亂，可見(jiàn)腎小管擴(kuò)張明顯，上皮細(xì)胞出現(xiàn)不同程度腫脹及空泡變性，部分刷狀緣消失，管腔出現(xiàn)壞死脫落的細(xì)胞甚至管型，腎間質(zhì)充血以及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。低氧預(yù)適應(yīng)組和遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)組腎小管擴(kuò)張程度減輕，上皮細(xì)胞壞死及管型減少。偶見(jiàn)間質(zhì)充血及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。聯(lián)合組腎臟病理?yè)p害明顯減輕，僅表現(xiàn)為腎小管輕度擴(kuò)張，偶見(jiàn)管型。見(jiàn)圖1。Paller評(píng)分見(jiàn)表2。

注：A:假手術(shù)組；B：缺血再灌注組；C：低氧預(yù)適應(yīng)組；D：遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)組；E：低氧聯(lián)合遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)組圖1 各組大鼠腎組織病理改變(×200)

表2 各組大鼠腎組織Paller評(píng)分(n=8)

2.3腎臟細(xì)胞凋亡情況：假手術(shù)組組織中極少數(shù)細(xì)胞發(fā)生凋亡，低氧預(yù)適應(yīng)和遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)組均可減輕缺血再灌注損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。而與低氧預(yù)適應(yīng)和遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)相比，聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡水平顯著降低。見(jiàn)圖2。凋亡指數(shù)見(jiàn)表3。

注：A:假手術(shù)組；B：缺血再灌注組；C：低氧預(yù)適應(yīng)組；D：遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)組；E：低氧聯(lián)合遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)組圖2 各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況(×400)

表3 各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(n=8)

2.4免疫組化觀察Caspase3和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平：與假手術(shù)組相比，腎缺血再灌注組大鼠的Caspase3表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)降低；與缺血再灌注組相比，低氧預(yù)適應(yīng)和遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)組Bcl-2表達(dá)升高，Caspase3表達(dá)降低；而與低氧預(yù)適應(yīng)和遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)組相比，聯(lián)合組Bcl-2表達(dá)明顯升高，而Caspase3表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。平均光密度值見(jiàn)表4。

注：A:假手術(shù)組；B：缺血再灌注組；C：低氧預(yù)適應(yīng)組；D：遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)組；E：低氧聯(lián)合遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)組圖3 各組大鼠Caspase3和Bcl-2表達(dá)情況(×400)

表4 各組大鼠Caspase3和Bcl-2平均光密度值(IOD/Area)(n=8)

3 討論

腎臟IRI是一種臨床常見(jiàn)的病理生理過(guò)程，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于如何減輕腎臟IRI進(jìn)行了大量研究，部分成果已經(jīng)運(yùn)用到了臨床工作中，但大多是藥物干預(yù)或者直接干預(yù)腎臟本身。藥物干預(yù)如雌激素等副作用較大，且隨著患者年齡增長(zhǎng)可能出現(xiàn)對(duì)藥物代謝率降低[9]。直接對(duì)腎臟干預(yù)不僅臨床操作不方便，而且是一種有創(chuàng)操作，且增加手術(shù)時(shí)間。低氧預(yù)適應(yīng)和遠(yuǎn)程缺血預(yù)適應(yīng)作為新興的非藥物干預(yù)措施已經(jīng)在多個(gè)器官如肝、腎、腦等表現(xiàn)出對(duì)IRI的保護(hù)作用。不僅操作簡(jiǎn)便，費(fèi)用較低，而且對(duì)患者損傷較小。本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用低氧預(yù)適應(yīng)及遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)探討了其對(duì)腎臟是否存在協(xié)同保護(hù)作用及其機(jī)制。

大量研究認(rèn)為雌激素對(duì)腎IRI具有保護(hù)作用，因此筆者選擇雄性大鼠作為研究對(duì)象保證樣本均一性，也有證據(jù)表明這種性別對(duì)腎IRI敏感性更高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腎IRI組BUN、Scr水平較假手術(shù)組明顯升高，說(shuō)明模型構(gòu)建成功。與腎IRI組比較，低氧預(yù)適應(yīng)組、遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)組及聯(lián)合組上述指標(biāo)降低。同時(shí)，光鏡下病理形態(tài)結(jié)果可見(jiàn)細(xì)胞壞死、水腫程度等明顯減輕，提示兩種預(yù)適應(yīng)均能減輕腎IRI，改善腎功能。且與兩種單獨(dú)預(yù)適應(yīng)相比，兩者聯(lián)合對(duì)腎功能及病理形態(tài)改善更明顯。

腎缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，常見(jiàn)的有氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、鈣超載以及細(xì)胞凋亡等，近年來(lái)大量研究表明，細(xì)胞凋亡在缺血再灌注過(guò)程中占重要地位，是腎IRI的重要環(huán)節(jié)[10-11]。抑制細(xì)胞凋亡過(guò)程可以有效預(yù)防腎IRI的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)TUNEL法結(jié)果顯示與腎IRI組相比，低氧預(yù)適應(yīng)組、遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)組及兩者聯(lián)合組細(xì)胞凋亡指數(shù)AI明顯降低，說(shuō)明三種干預(yù)措施在一定程度上均能減少大鼠腎組織細(xì)胞凋亡。與低氧預(yù)適應(yīng)或遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)組比較，兩者聯(lián)合細(xì)胞凋亡更少。查閱文獻(xiàn)，腎IRI過(guò)程中的細(xì)胞凋亡由一系列繁瑣的級(jí)聯(lián)反應(yīng)所引起，有多種凋亡相關(guān)蛋白參與，而B(niǎo)cl-2和Caspase3是其中重要的兩種凋亡蛋白[12]。大量證據(jù)表明在腎IRI過(guò)程中提升Bcl-2的表達(dá)可以抑制細(xì)胞凋亡，而抑制內(nèi)源性Bcl-2蛋白的表達(dá)或者消除Bcl-2反而會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡加重腎IRI[13]。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程免疫組化結(jié)果顯示，與腎IRI模型組比較，低氧預(yù)適應(yīng)、遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)及聯(lián)合組Bcl-2蛋白表達(dá)增多，兩者聯(lián)合組增多更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且其與各組間細(xì)胞凋亡趨勢(shì)相反，兩者聯(lián)合組細(xì)胞凋亡較少，這表明低氧預(yù)適應(yīng)及遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)在腎IRI過(guò)程中可能通過(guò)提高Bcl-2表達(dá)減少細(xì)胞凋亡從而改善腎IRI。

目前較多研究認(rèn)為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶Caspase依賴的細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷過(guò)程中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要途經(jīng)。激活的Caspase以瀑布式的活化方式活化，而Caspase3是其中最關(guān)鍵的一種蛋白酶。Caspase3是一種在正常細(xì)胞以無(wú)活性酶原形式存在的蛋白酶，其位于細(xì)胞凋亡下游，是各種細(xì)胞凋亡通路的必經(jīng)之路。受多種凋亡刺激因素介導(dǎo)后激活，活化的Caspase3可引起一系列細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，如細(xì)胞固縮、凋亡小體形成和DNA分解等，最終促使細(xì)胞凋亡發(fā)生[14]。天然或合成的Caspase3抑制劑可以顯著減輕甚至阻斷多種刺激引起的細(xì)胞凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示，腎IRI組Caspase3蛋白表達(dá)明顯升高，低氧預(yù)適應(yīng)、遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)及聯(lián)合組Caspase3蛋白表達(dá)較腎IRI模型組降低。與低氧預(yù)適應(yīng)或遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)相比，兩者聯(lián)合組降低更明顯。Caspase3蛋白表達(dá)與各組間細(xì)胞凋亡分布一致。說(shuō)明低氧預(yù)適應(yīng)及遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)能夠通過(guò)抑制Caspase3表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生。

綜上所述，低氧預(yù)適應(yīng)及遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)均能降低腎IRI，且低氧聯(lián)合遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)腎IRI改善更明顯，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)Caspase3表達(dá)和上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。但其對(duì)腎IRI過(guò)程細(xì)胞凋亡的具體調(diào)控機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。