聶付芳，楊培峰，杜淑文，任方

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院/河南省婦幼保健院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450052)

0 引言

子癇前期是一種妊娠特異性疾病，其特點是妊娠20周后出現(xiàn)新發(fā)高血壓和/或伴隨的臨床和實驗室指標(biāo)的變化，是嚴(yán)重危害母胎健康的主要原因，其全球發(fā)病率為3%～8%；胎盤娩出后臨床癥狀自行消失。而發(fā)生于34周之前的子癇前期被稱為早發(fā)型子癇前期(EOPE)，其病情進(jìn)展迅速，且常合并多種并發(fā)癥，嚴(yán)重時甚至直接導(dǎo)致胎兒死亡，對母嬰的身體健康造成了嚴(yán)重的威脅[1]。滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤及侵襲不足、螺旋小動脈的不完全重塑、血管阻力增大，胎盤灌注減少，缺血缺氧，被認(rèn)為在此疾病病因中起著重要作用[2,3]。

目前子癇前期的發(fā)病機(jī)制依然不明，在胎盤發(fā)育的整個過程中，細(xì)胞因子通過參與滋養(yǎng)細(xì)胞的信號對話，實現(xiàn)對胎盤發(fā)育的調(diào)控作用，其中TGF-β/Smad通路參與了機(jī)體廣泛的生理活動，例如滋養(yǎng)細(xì)胞的分化、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)和胎盤植入[4]。近年來，有大量研究認(rèn)為TGF-β/Smad通路成員的傳導(dǎo)紊亂在子癇前期的發(fā)生發(fā)展中起重要作用?，F(xiàn)對該通路的主要成員受體激活型Smad2、抑制型Smad7及其下游因子MMP-9在子癇前期的發(fā)生發(fā)展所扮演的角色進(jìn)行探討。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取自2019年1月至2020年10月于我院分娩的EOPE孕婦的胎盤組織30例作為實驗組，另取同期正常分娩的孕婦胎盤組織30例作為對照組.納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均為單胎妊娠，胎兒無畸形；(2)所有納入對象均符合EOPE相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(3)孕期均在本院進(jìn)行完整的產(chǎn)前檢查，且資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)孕期檢查發(fā)現(xiàn)存在妊娠期糖尿病、腎臟疾病、血液系統(tǒng)疾病以及甲狀腺功能異常；(2)孕期接受過心腦血管藥物治療或心血管疾??；(3)子宮先天性發(fā)育異?；蛱ケP異常；(4)無法正常交流溝通或伴有精神疾病。兩組年齡、孕次、體重指數(shù)(BMI)、產(chǎn)次等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。本研究已獲本院倫理委員會審查批準(zhǔn)，所有研究對象均已簽署知情同意書。

表1 對照組和SPE組孕婦一般臨床資料

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集與制備

胎盤娩出后，立即取胎盤母體面中央?yún)^(qū)域，剪除底蛻膜層，避開鈣化壞死區(qū)，取叢密絨毛膜層組織2塊，大小約為1.0cm×1.0cm×0.5cm，4℃生理鹽水沖洗，10%中性甲醛固定24h，石蠟包埋，4μm厚切片備用。

1.2.2 主要試劑

上海生工兔抗人Smad2、Smad7及MMP-9多克隆抗體。

1.2.3 免疫組化

將標(biāo)本連續(xù)切片，脫蠟，水化，抗原熱修復(fù)，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，封閉液室溫孵育30min，滴入一抗，恒溫4℃冰箱過夜，滴加二抗，再次孵育30min，上述間隔均需用PBS沖洗，DAB顯色約10min，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，最后封片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行臨床資料統(tǒng)計學(xué)分析。Image J軟件進(jìn)行圖像分析，graphpad 7進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)分析。檢驗計量資料數(shù)據(jù)的正態(tài)性及方差齊性，若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布，則以(±s)表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)，并用Bonferroni法進(jìn)行事后檢驗；P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

MMP-9蛋白主要表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色染色。1A：正常組，胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞可見大量棕黃色顆粒，部分血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中可見黃色顆粒。1B：早發(fā)型子癇前期組，胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)可見淺黃色染色，部分細(xì)胞核可見淺黃色染色。1C：Image J軟件對MMP-9的免疫組化結(jié)果圖進(jìn)行半定量分析，*P＜0.05，表示統(tǒng)計學(xué)有意義。

Smad7蛋白主要表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和部分細(xì)胞核中，呈棕黃色染色。2A：正常組，胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)及部分細(xì)胞核中可見大量棕黃色顆粒。2B：早發(fā)型子癇前期組，胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及部分細(xì)胞核中可見淺黃色顆粒。2C：Image J軟件對Smad7的免疫組化結(jié)果圖進(jìn)行半定量分析，*P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Smad2蛋白主要表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及部分細(xì)胞核中呈棕黃色染色。3A：正常組，胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中可見淺黃色染色。3B：早發(fā)型子癇前期組，胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)及部分細(xì)胞核中可見大量棕黃色顆粒。3C：Image J軟件對Smad2的免疫組化結(jié)果圖進(jìn)行半定量分析，*P＜0.05，表示統(tǒng)計學(xué)有意義。

2.1 兩組孕婦的胎盤組織中MMP-9蛋白表達(dá)結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示：MMP-9蛋白主要表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色染色見圖1(1A-1B)。且早發(fā)型子癇前期組的染色程度弱于正常組，見圖1(1C)；差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，*P＜0.05。

圖1 免疫組化結(jié)果顯示

2.2 兩組孕婦的胎盤組織中Smad7蛋白表達(dá)結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示：Smad7蛋白主要表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)以及部分細(xì)胞核，呈棕黃色染色見圖2(2A-2B)。早發(fā)型子癇前期組的染色程度明顯低于正常組，見圖2(2C)；差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，*P＜0.05。

圖2 免疫組化結(jié)果顯示

2.3 組孕婦的胎盤組織中Smad2蛋白表達(dá)結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示：Smad2蛋白主要表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)以及部分細(xì)胞核，呈棕黃色染色見圖3(3A-3B)。且早發(fā)型子癇前期組的染色程度高于正常組，見圖3(3C)；差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，*P＜0.05。

圖3 免疫組化結(jié)果顯示

3 討論

子癇前期多在妊娠20周以后出現(xiàn)，即胎盤功能成熟后開始發(fā)病，在胎盤娩出后病情得到迅速緩解，提示胎盤可能在子癇前期發(fā)病中起著關(guān)鍵作用[6]。Kadyrov[7]等人研究發(fā)現(xiàn)早發(fā)型子癇前期患者胎盤著床部位的子宮全層標(biāo)本中，滋養(yǎng)細(xì)胞侵入不足，胎盤組織細(xì)胞凋亡明顯增加，螺旋小動脈重塑不足，管腔狹窄，胎盤著床較淺，故得出早發(fā)型重度子癇前期更傾向于是一種胎盤疾病。近年來的研究表明晚發(fā)型子癇前期胎盤的滋養(yǎng)細(xì)胞不存在過度凋亡現(xiàn)象，推測晚發(fā)性子癇前期的發(fā)病原因可能與胎盤關(guān)系不大，而與母體因素有關(guān)[8]。故而得出早發(fā)型子癇前期和晚發(fā)性子癇前期可能存在不同的發(fā)病機(jī)制。

就目前而言子癇前期的發(fā)病機(jī)制主要有子宮螺旋小動脈重鑄不足、胎盤淺著床、炎癥反應(yīng)過度激活、血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、滋養(yǎng)細(xì)胞過度凋亡等幾種學(xué)說。研究表明TGF-β/Smad通路不僅在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，而且也在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)中擔(dān)當(dāng)了重要角色，EMT可能是促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移所必須經(jīng)歷的一個過程。Smad蛋白與轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族配體相結(jié)合傳遞信號，其通過激活絲氨酸/蘇氨酸激酶受體來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。Smad的蛋白在各種生物體及人類各組織中均有表達(dá)。Smad蛋白按其功能分為3類：一類是受體調(diào)節(jié)型R-Smad，可直接與受體結(jié)合，包括Smad1、2、3、5、8；一類是共同結(jié)合型Co-Smad，只有Smad4一種；最后一類是抑制型I-Smad，包括Smad6、7[9]。抑制型受體通過干擾R-Smad的磷酸化或競爭性抑制R-Smad和Co-Smad之間復(fù)合物的形成來抑制兩組的信號功能[10]。然而Smad6會優(yōu)先抑制BMP[11]；而Smad7抑制活化素、TGF-β及BMP信號通路[12]。

抑制型Smad7已被證明是TGF-b信號通路的細(xì)胞內(nèi)拮抗劑[13]。于洪等人的研究表明，在心臟重塑過程中，Smad7可抑制MMP-9的活性[14]，而Seiya Kato等人的研究表明Smad7過表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖[15]；Sangmin Kim等人的研究表明在乳腺癌細(xì)胞中，表皮生長因子(the epidermal growth factor；EGF)誘導(dǎo)的MMP-9的表達(dá)被Smad7的過表達(dá)完全抑制，進(jìn)而推斷Smad7可能抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移作用[16]，這說明了Smad7對機(jī)體得調(diào)控受表達(dá)量影響。

絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞得侵襲和遷移常伴有細(xì)胞外基質(zhì)得降解和重塑。MMPs是細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑的關(guān)鍵酶，MMP-9是一類結(jié)構(gòu)中含有鋅和鈣的蛋白水解酶，在體內(nèi)主要參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解，MMP-9可降解大部分變性的膠原及IV、V型膠原。滋養(yǎng)細(xì)胞侵入母體的過程包括滋養(yǎng)細(xì)胞的黏附、基質(zhì)的溶解和細(xì)胞的遷移。其中，基質(zhì)的溶解是侵蝕過程的重要環(huán)節(jié)，滋養(yǎng)細(xì)胞本身并不能吞噬溶解基質(zhì)，但可分泌作用于細(xì)胞外基質(zhì)的酶。其中MMP-9是降解蛻膜基質(zhì)的重要酶類[17]；其主要功能是降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡，研究報道MMP-9是調(diào)節(jié)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和侵襲所必須的[18]。

本研究的免疫組化結(jié)果顯示，Smad7蛋白于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中均有表達(dá)；且早發(fā)型子癇前期組胎盤組織中的表達(dá)量明顯低于正常妊娠胎盤組。MMP-9蛋白主要表達(dá)于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中也均有表達(dá)，且早發(fā)型子癇前期組胎盤組織中的表達(dá)量明顯低于正常妊娠胎盤組織。Smad2蛋白主要表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)以及部分細(xì)胞核，且早發(fā)型子癇前期胎盤組織中的表達(dá)量高于正常妊娠胎盤組織。說明Smad7和MMP-9于早發(fā)型子癇前期的發(fā)病中的作用可能存在正相關(guān)性，而Smad2與MMP-9的表達(dá)于早發(fā)型子癇前期的發(fā)病中可能存在負(fù)相關(guān)性。根據(jù)前人對TGF-β/Smad的研究推測Smad7的低表達(dá)可能降低了其對TGFβ1-Smad2/smad3表達(dá)的抑制，導(dǎo)致此信號通路的過表達(dá)，從而抑制了MMP-9的表達(dá)，近而抑制絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲，參與子癇前期的發(fā)病[19]。

雖然Smad7的作用是有爭議的，但我們的結(jié)果表明，較正常胎盤組織，早發(fā)型子癇前期胎盤組織中Smad7和MMP-9表達(dá)均下降，而Smad2在早發(fā)型子癇前期組呈高表達(dá)狀態(tài)，提示Smad7和MMP-9在子癇前期發(fā)病中可能存在正相關(guān)性，而Smad2和MMP-9在子癇前期發(fā)病中可能存在負(fù)相關(guān)性。