崔培，尚東維，劉文軍，孫金輝*

(1.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院,天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384; 2.天津市嘉禾田源觀賞魚養(yǎng)殖有限公司，天津 301811)

紅曲米(red koji rice)也稱紅曲，是以秈稻、粳稻、糯米等稻米為原料，經(jīng)紅曲霉菌(monascus)發(fā)酵而成的棕紅色或紫紅色的純天然無污染米曲，具有良好的著色性和多種功能活性，紅曲米包含多種功能成分，主要有洛伐他汀類(monacolin K，膽固醇降低劑)、紅曲色素(食品著色劑)、二甲酸(一種抗氧化劑)、麥角甾醇(ergosterol)、抗菌活性物質(zhì)、酶類活性物質(zhì)和γ-氨基丁酸(一種抗高血壓物質(zhì))等化合物[1-4]，其中，紅曲色素是一種安全性極高的天然食用色素及防腐劑，目前已被廣泛用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域，被認(rèn)為是化學(xué)防腐劑的最佳替代品之一[5-6]。洛伐他汀類是膽固醇生物合成的抑制劑，能夠有效調(diào)節(jié)人和其他動(dòng)物的血清膽固醇含量[7]，在醫(yī)學(xué)臨床上具有廣泛的用途，如洛伐他汀類是治療人高膽固醇血癥最有效的藥物之一，還能防止或緩解動(dòng)脈硬化和冠心病等[8]。此外，紅曲米還兼具抗氧化、抗腫瘤、抗應(yīng)激、預(yù)防癌癥、增強(qiáng)免疫力等重要生物學(xué)功能[9]。目前，紅曲米作為功能性飼料添加劑主要用于禽類養(yǎng)殖。研究證實(shí)，蛋雞飼料中添加0.5%的富含紅曲色素微生物發(fā)酵飼料可提高蛋雞生產(chǎn)性能，改善雞蛋品質(zhì)[10]。此外，對(duì)海蘭褐蛋雞的研究也發(fā)現(xiàn)，添加0.5%紅曲霉-中草藥復(fù)合物(以紅曲粉為主，與山藥、神曲、山楂和紅棗配伍而成)能有效緩解其產(chǎn)蛋后期生產(chǎn)性能下降的趨勢(shì)，并有效增強(qiáng)蛋殼厚度，加深蛋黃色澤[11]。但在水產(chǎn)動(dòng)物方面，僅見紅曲米作為魚類防腐劑或保鮮劑使用[12]，尚缺乏紅曲米作為飼料添加劑的使用研究。

錦鯉Cyprinuscarpio因其體格健美、色彩艷麗、花紋多變而廣受消費(fèi)者喜愛，其觀賞價(jià)值主要取決于體色和體型。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于錦鯉體色的研究已有一些報(bào)道[13-15]，但關(guān)于紅曲米作為飼料添加劑對(duì)錦鯉生長(zhǎng)、著色、健康方面的影響尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)中，以紅白錦鯉幼魚為研究對(duì)象，探討不同紅曲米添加量對(duì)幼魚生長(zhǎng)性能、色素積累及部分血液和肝胰臟生化指標(biāo)等的影響，以期為紅曲米作為錦鯉飼料添加劑的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用紅白錦鯉幼魚購(gòu)自天津市隆錦水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，試驗(yàn)在天津市隆錦水產(chǎn)養(yǎng)殖公司車間進(jìn)行，紅曲米購(gòu)自西安澤邦生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)飼料配制 以魚粉、玉米蛋白粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕等為蛋白源，大豆油為脂肪源，添加不同水平紅曲米。

基礎(chǔ)飼料原料組分為菜籽粕20%，豆粕18%，玉米蛋白粉15%，棉籽粕12%，面粉9.5%，小麥麩8%，魚粉6%，豆油5%，預(yù)混料4%，微晶纖維素2%，氧化膽堿0.5%。其中，每千克預(yù)混料含維生素A≥25 000 IU，維生素D312 500～50 000 IU，維生素E≥800 IU，維生素K3≥100 mg，維生素B1≥60 mg，維生素B2≥160 mg，維生素B6≥200 mg，泛酸≥300 mg，葉酸≥11 mg，煙酸≥510 mg，錳60～800 mg，鐵480～18 750 mg，鋅500～5 000 mg，銅20～100 mg，硒2.5～12.5 mg。

在基礎(chǔ)飼料中分別添加紅曲米0(對(duì)照)、0.5、1.0、1.5、3.0 g/kg，配制成5組試驗(yàn)飼料。其中，紅曲米為深紅色精細(xì)粉末，洛伐他丁含量為1.3%。所有固體飼料原料均過198 μm篩，原料逐級(jí)放大混勻后，用雙螺桿制粒機(jī)(華南理工大學(xué)機(jī)械工程研究所制造)制成顆粒飼料，每組飼料設(shè)兩種規(guī)格(Φ=1.5、2.0 mm)，在烘箱(DK400, YAMATO)中40 ℃下烘干2 h，取出后自然風(fēng)干至水分為12%左右，于-20 ℃冰箱中保存，飼料營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 飼料營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)開始前將紅白錦鯉幼魚暫養(yǎng)14 d以適應(yīng)環(huán)境。暫養(yǎng)期間投喂不添加紅曲米的基礎(chǔ)飼料，暫養(yǎng)結(jié)束后，挑選身體健康、外表無傷、初始體質(zhì)量為(8.79±1.80)g的紅白錦鯉幼魚450尾，隨機(jī)分為5組，每組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行組放置30尾魚，飼喂含紅曲米的飼料第56 天時(shí)，取樣檢測(cè)幼魚生長(zhǎng)、生化指標(biāo)。而后，余下的魚使用基礎(chǔ)飼料繼續(xù)投喂14 d，停喂紅曲米飼料第0、7、14天時(shí)，取樣檢測(cè)體表色度值和各組織類胡蘿卜素含量，養(yǎng)殖周期共為70 d。試驗(yàn)期間，每日8:00和16:30投喂，每日投喂量約為魚體質(zhì)量的3%，每日吸除缸底糞便和殘餌，每日換水1次，每次換水量為總水量的1/3，所換水均經(jīng)24 h曝氣。試驗(yàn)期間水溫為(25.0±1.0)℃，pH為7.6～7.8，氨氮含量≤0.05 mg/L，溶解氧含量≥6.0 mg/L。

1.2.3 樣品采集 經(jīng)56 d飼養(yǎng)后，試驗(yàn)魚禁食24 h，經(jīng)丁香酚(1∶10 000)麻醉后，稱重并記錄魚的數(shù)量。從每只水槽隨機(jī)取10尾試驗(yàn)魚，測(cè)定其體表L*、a*、b*值(此為停喂0 d的色度值)，于后尾部采血，將血液離心5 min(4 ℃，3 500 r/min)，取上清液保存?zhèn)溆?，用于檢測(cè)血液生化指標(biāo)；采血后的試驗(yàn)魚于冰盤上解剖取其肝胰臟和皮膚，用于檢測(cè)肝胰臟生化指標(biāo)和類胡蘿卜素含量(此為停喂0 d時(shí)的類胡蘿卜素含量)。之后在停喂紅曲米飼料的第7、14天時(shí)，從每槽隨機(jī)取6尾試驗(yàn)魚，測(cè)定其體表L*、a*、b*值，用上述方法采集皮膚、肝胰臟、腸道、眼組織，所有樣品均于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 指標(biāo)的測(cè)定與計(jì)算

1)生長(zhǎng)指標(biāo)的計(jì)算。計(jì)算公式為

增重率(WG)=(Wt-W0)/W0×100%，

(1)

特定生長(zhǎng)率(SGR)=(lnWF-lnWI)/t×100%，

(2)

飼料效率(FE)=(Wt+Wd-W0)/C，

(3)

攝食率(FI)=C/[t(Wt+W0)/2]×100%，

(4)

成活率(SR)=成活數(shù)/總數(shù)×100%。

(5)

其中:W0為試驗(yàn)魚初始總質(zhì)量(g)；Wt為試驗(yàn)魚終末總質(zhì)量(g)；Wd為死亡試驗(yàn)魚總質(zhì)量(g)；WI為魚體初始平均質(zhì)量(g)；WF為魚體終末平均質(zhì)量(g)；t為試驗(yàn)時(shí)間(d)；C為攝餌量(干質(zhì)量, g)。

2)一般營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定。采用恒重恒壓干燥法(GB/T5009.3—2010)、杜馬斯燃燒法(Thermo fisher scientific FLASH2000全自動(dòng)蛋白測(cè)定儀)(GB/T24318—2009)、索氏抽提法(Gerhardt SOXTHERM)(GB/T5009.6—2010)、灼燒重量法(GB/T5009.4—2010)，分別測(cè)定水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量。

3)血液和肝胰臟生化指標(biāo)的測(cè)定。血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、血糖(blood glucose，Glu)、甘油三酯(triglyceride，TG)及總膽固醇(total cholesterol，Chol)送至天津市金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所檢驗(yàn)，采用羅氏(Roche C311,German)全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

采用南京建成生物工程研究所試劑盒分別測(cè)定肝胰臟丙二醛(malondialdehyde，MDA)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，T-SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)含量。

4)體表色度值的測(cè)定。采用色差儀(CR-400)測(cè)定錦鯉體表紅質(zhì)L*、a*、b*值。

5)類胡蘿卜素含量的測(cè)定。取適量樣品記錄樣品質(zhì)量，對(duì)紅白錦鯉紅色的皮膚(帶鱗片)、背鰭、尾鰭、眼、肝胰臟、腸道及飼料進(jìn)行總類胡蘿卜素含量(mg/kg)的測(cè)定，計(jì)算公式為

總類胡蘿卜素含量=(A×K×V)/(E×G)。

(6)

其中：A為吸光度值；K為常數(shù)(104)；V為提取液體積(mL)；E為摩爾消光系數(shù)(2 500)；G為樣品質(zhì)量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，采用Tukey法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼喂紅曲米飼料56 d后幼魚生長(zhǎng)指標(biāo)的變化

從表2可見：投喂紅曲米飼料56 d后，各組試驗(yàn)魚存活率為87.78%～100.00%，組間無顯著性差異(P>0.05)；飼料中添加紅曲米均能顯著提高試驗(yàn)魚增重率、特定增長(zhǎng)率及飼料效率(P<0.05)，且添加量為1.5 g/kg時(shí)，各指標(biāo)均達(dá)到最大值；而不同紅曲米添加量對(duì)試驗(yàn)魚攝食率無顯著性影響(P>0.05)。

表2 飼喂56 d后不同紅曲米添加量對(duì)紅白錦鯉幼魚生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

2.2 飼喂紅曲米飼料56 d后紅白錦鯉幼魚部分血液生化指標(biāo)的變化

從表3可見，投喂紅曲米飼料56 d后，與對(duì)照組(0 g/kg)相比，各試驗(yàn)組魚體血糖含量及谷草轉(zhuǎn)氨酶活性均顯著降低(P<0.05)，而各試驗(yàn)組魚體甘油三酯、總膽固醇含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均無顯著性變化(P>0.05)。

表3 飼喂56 d后不同紅曲米添加量對(duì)紅白錦鯉幼魚部分血液指標(biāo)的影響

2.3 飼喂紅曲米飼料56 d后紅白錦鯉幼魚部分肝胰臟生化指標(biāo)的變化

從表4可見：投喂紅曲米飼料56 d后，飼料中紅曲米添加量為1.5 g/kg時(shí)，試驗(yàn)魚肝胰臟GSH-PX酶活力顯著高于對(duì)照組及0.5、1.0 g/kg紅曲米添加組(P<0.05)；飼料中紅曲米添加量為3.0 g/kg時(shí)，試驗(yàn)魚MDA含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；添加紅曲米的試驗(yàn)魚肝胰臟中SOD、CAT活性與對(duì)照組相比均無顯著性差異(P>0.05)。

表4 飼喂56 d后不同紅曲米添加量對(duì)紅白錦鯉幼魚部分肝胰臟生化指標(biāo)的影響

2.4 停喂紅曲米后不同時(shí)期幼魚體色的變化

2.4.1 體表L*、a*、b*值 從表5可見：停喂紅曲米0 d時(shí)，隨著紅曲米添加量的增加，試驗(yàn)魚體表a*值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，1.0 g/kg組的a*值達(dá)到最大且顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；停喂7 d時(shí)，試驗(yàn)魚體表a*值變化趨勢(shì)與0 d時(shí)一致，峰值仍出現(xiàn)在1.0 g/kg組，且顯著高于0、1.5 g/kg組(P<0.05)；停喂14 d時(shí)，紅曲米添加量為1.0 g/kg及以上時(shí)，試驗(yàn)魚體表a*值顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；而隨著停喂時(shí)間的延長(zhǎng)，除對(duì)照組a*值顯著降低外(P<0.05)，其余紅曲米添加組均無顯著性變化(P>0.05)。而不同紅曲米添加量及停喂時(shí)間對(duì)紅白錦鯉體表b*值、L*值均無顯著性影響(P>0.05)。

表5 停喂紅曲米0、7、14 d時(shí)錦鯉體表色度值的變化

2.4.2 皮膚中的類胡蘿卜素含量 從表6可見：停喂紅曲米0 d時(shí)，隨著飼料中紅曲米含量的增加，紅白錦鯉皮膚中的類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，添加量為1.0～1.5 g/kg時(shí)，錦鯉體表類胡蘿卜素含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；停喂7 d時(shí)，1.0 g/kg 組試驗(yàn)魚皮膚中類胡蘿卜素含量最高且顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；停喂14 d時(shí)，各試驗(yàn)組魚皮膚中的類胡蘿卜素含量與對(duì)照組相比，均無顯著性差異(P>0.05)。紅曲米添加量為1.0～1.5 g/kg時(shí)，隨著停喂時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)魚皮膚中類胡蘿卜素含量顯著降低(P<0.05)。

表6 停喂紅曲米0、7、14 d時(shí)錦鯉皮膚組織中類胡蘿卜素含量的變化

2.4.3 其他組織器官中的類胡蘿卜素含量 從表7可見：停喂紅曲米7 d時(shí)，3.0 g/kg組錦鯉尾鰭、眼中類胡蘿卜素含量顯著高于對(duì)照組，腸道中類胡蘿卜素含量則顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而添加紅曲米未對(duì)試驗(yàn)魚背鰭、肝胰臟中類胡蘿卜素含量造成顯著性影響(P>0.05)；停喂14 d時(shí)，紅曲米試驗(yàn)組間魚眼及肝胰臟中的類胡蘿卜素含量總體上與對(duì)照組相比無顯著性差異(P>0.05)，紅曲米添加量為1.5 mg/kg 及以上時(shí)，試驗(yàn)魚背鰭、尾鰭中的類胡蘿卜素含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而腸道中類胡蘿卜素含量則顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表7 停喂紅曲米7、14 d時(shí)錦鯉其他組織器官中類胡蘿卜素含量的變化

3 討論

3.1 紅曲米對(duì)紅白錦鯉幼魚生長(zhǎng)的影響

目前，有關(guān)紅曲米作為飼料添加劑的報(bào)道主要集中在家禽飼料的研究上。付興周等[16]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加1%紅曲復(fù)合添加劑對(duì)肉仔雞的生長(zhǎng)性能具有促進(jìn)作用。對(duì)蛋雞的研究結(jié)果顯示，基礎(chǔ)日糧中添加紅曲霉發(fā)酵料能有效提高蛋雞的產(chǎn)蛋率，降低料蛋比，提高蛋雞生產(chǎn)性能[6]。本試驗(yàn)中，在飼料中添加紅曲米后能顯著提高各組試驗(yàn)魚的增重率、特定生長(zhǎng)率及飼料效率，這說明紅曲米能夠有效提高紅白錦鯉幼魚的生長(zhǎng)性能和飼料利用。其原因有兩方面：一是紅曲霉在代謝過程中產(chǎn)生的多種酶類，如蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、糖化酶、葡萄糖淀粉酶等，這些酶能夠降解飼料中難以消化的大分子物質(zhì)，有助于提高飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率[11]；二是紅曲米中含有的抑菌活性物質(zhì)可能對(duì)腸道菌群具有一定調(diào)節(jié)作用，從而對(duì)生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定影響。

3.2 紅曲米對(duì)紅白錦鯉幼魚血液生化指標(biāo)的影響

眾多人和動(dòng)物的試驗(yàn)結(jié)果表明，紅曲米具有良好的降脂作用。Ross[17]臨床研究中發(fā)現(xiàn)，紅曲米可將人血清低密度脂蛋白水平降低10%～33%。對(duì)患高脂血癥的大鼠[18]或倉(cāng)鼠[19]研究顯示，在攝入紅曲米后，大鼠或倉(cāng)鼠血清中甘油三酯、總膽固醇及低密度脂蛋白含量均顯著降低，而低密度脂蛋白和總膽固醇能夠影響VIIa-組織凝血活酶復(fù)合物的活性，進(jìn)而影響血液的抗凝能力。類似結(jié)果也出現(xiàn)在對(duì)AS兔[20]及蛋雞[6]的研究中。本試驗(yàn)中，添加紅曲米對(duì)試驗(yàn)魚血清膽固醇和甘油三酯均無顯著性影響，說明紅曲米對(duì)紅白錦鯉幼魚的降脂效果不明顯，其原因可能與較多因素相關(guān)，如試驗(yàn)對(duì)象、試驗(yàn)飼料及養(yǎng)殖條件等，具體原因有待進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。Shi等[21]在由鏈脲佐菌素(STC)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠日料中添加紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)品，飼喂8周后發(fā)現(xiàn)，3種不同紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)品均能顯著降低糖尿病大鼠的血糖含量，提高大鼠血清胰島素水平，證實(shí)紅曲制品對(duì)于降低血糖具有良好效果。Wang等[22]的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，紅曲通過促進(jìn)胰島素分泌降低糖尿病小鼠的血糖水平。本試驗(yàn)與上述結(jié)果相類似，添加紅曲米后，各組試驗(yàn)魚血糖含量均顯著降低，這說明對(duì)于紅白錦鯉幼魚而言，紅曲米也具備良好的降糖效果。此外，本試驗(yàn)中各組試驗(yàn)魚血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著降低，這與Lee等[19]對(duì)患高脂血癥大鼠的研究結(jié)果相一致，這說明在飼料中添加紅曲米會(huì)在一定程度上緩解肝臟損傷。

3.3 紅曲米對(duì)紅白錦鯉幼魚肝胰臟生化指標(biāo)的影響

SOD和CAT是機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)中重要的防御性抗氧化功能因子，能夠清除機(jī)體內(nèi)活性氧自由基，MDA是機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度的重要衡量指標(biāo)，反映了機(jī)體肝臟損傷程度[23-24]。GSH-PX則是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，能夠減少脂質(zhì)過氧化物的生產(chǎn)，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的作用[25]。本試驗(yàn)中，1.5 g/kg紅曲米添加組試驗(yàn)魚GSH-PX活性顯著升高，這說明紅曲米可能對(duì)提高紅白錦鯉幼魚的抗氧化能力有積極作用，這與對(duì)糖尿病大鼠[21]和蛋雞[26]的研究結(jié)果相一致。而MDA含量在紅曲米添加量為3.0 g/kg時(shí)顯著升高，提示添加高濃度的紅曲米可能對(duì)試驗(yàn)魚的肝胰臟造成負(fù)面影響。

3.4 紅曲米對(duì)紅白錦鯉幼魚體色的影響

本試驗(yàn)中，紅曲米添加量為1.0 g/kg時(shí)，紅白錦鯉幼魚皮膚a*值及類胡蘿卜素含量均顯著升高，這說明紅曲米對(duì)紅白錦鯉幼魚具有良好的增色效果，而隨著紅曲米添加量繼續(xù)升高，皮膚a*值及類胡蘿卜素含量反而下降到對(duì)照組水平，也表明了機(jī)體對(duì)類胡蘿卜素的吸收有最大限度。這與筆者前期采用不同脂肪水平的螺旋藻飼料投喂錦鯉的研究結(jié)果相一致[27]。停喂紅曲米飼料后，錦鯉體內(nèi)各組織器官中類胡蘿卜素含量均隨停喂時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，但停喂7、14 d時(shí)，1.0 g/kg組紅白錦鯉幼魚皮膚a*值仍顯著高于對(duì)照組，且錦鯉皮膚、背鰭、尾鰭中的類胡蘿卜素含量相對(duì)較高。這與張春蘭等[28]及姜志強(qiáng)等[13]發(fā)現(xiàn)的錦鯉吸收的色素主要沉積于體表的研究結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

1)在飼料中添加紅曲米可有效提高紅白錦鯉幼魚生長(zhǎng)性能，降低血糖含量。

2)飼料中添加1.0 g/kg紅曲米能有效改善紅白錦鯉幼魚的體色，可維持14 d不褪色。

3)飼料中添加紅曲米對(duì)提高紅白錦鯉幼魚肝胰臟的抗氧化能力效果不明顯。

綜上所述，在本試驗(yàn)條件下，紅曲米的最適宜添加量為1.0 g/kg，可維持14 d。