楊晴晴，金祎雯，李偉，趙菲，孔亮，佟長青*

(1.大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.大連海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，遼寧 大連 116023)

腐敗希瓦氏菌Shewanellaputrefaciens是魚蝦貝等新鮮水產(chǎn)品的典型腐敗菌(specific spoilage organism)。在水產(chǎn)品冷藏期間，該菌在還原氧化三甲胺的同時(shí)產(chǎn)生H2S，進(jìn)而使得這些冷藏水產(chǎn)品呈現(xiàn)出酸臭腐敗味[1-4]。由于腐敗希瓦氏菌在水產(chǎn)品表面產(chǎn)生被膜，且較難清除，給水產(chǎn)品加工與貯藏帶來嚴(yán)重危害[5]。利用天然生物活性物質(zhì)可以抑制富含蛋白質(zhì)的水產(chǎn)品保鮮貯藏過程中的腐敗希瓦氏菌[6-9]。因此，預(yù)防保鮮過程中腐敗問題的關(guān)鍵是抑制腐敗希瓦氏菌。

凝集素是一種非酶、非免疫球蛋白的多價(jià)糖結(jié)合蛋白或蛋白質(zhì)。水生生物來源的凝集素具有抑菌活性，這對食品保鮮尤為重要，已經(jīng)成為近年來的研究熱點(diǎn)。Liu等[10]、Huang等[11]和Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，許多水生生物來源的凝集素具有較好的抑菌活性。但生物體內(nèi)凝集素含量較低，且對其抑菌機(jī)制尚不明確，這阻礙了水生生物凝集素的實(shí)際應(yīng)用。天然生物保鮮劑，尤其是水生生物來源的凝集素，是一種來源安全、潛在的可應(yīng)用于水產(chǎn)品加工與貯藏中的天然生物抑菌劑。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum多種凝集素為其天然免疫因子[13-21]，對多種微生物具有天然抵抗防御作用。盡管有不少學(xué)者對菲律賓蛤仔凝集素與微生物相互作用進(jìn)行了較多研究，但未見其抑制腐敗希瓦氏菌機(jī)制的報(bào)道。本研究中，利用固相吸附分析了菲律賓蛤仔凝集素(MCL-T)與腐敗希瓦氏菌外膜蛋白(outer membrane proteins, OMP)的相互作用，利用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組方法分析了MCL-T作用前后腐敗希瓦氏菌蛋白表達(dá)的變化，以期從分子水平上獲得MCL-T抑菌機(jī)制，為MCL-T在水產(chǎn)品加工與貯藏中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

腐敗希瓦氏菌模式菌株CICC22940由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。

試劑:無菌綿羊血(20%)(上海伊卡生物技術(shù)有限公司)；辣根過氧化物酶(HRP)、牛血清蛋白(BSA)(北京索萊寶科技有限公司)；胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)(青島海博生物技術(shù)有限公司)；十二烷基硫酸鈉(SDS)、尿素、二硫蘇糖醇(DTT)、吲哚乙酸(IAA)(美國Bio-Rad公司)；BCA定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；胰蛋白酶(Trypsin)(美國Promega公司)；相對分子質(zhì)量為10 000的超濾離心管(德國Sartorius公司)；其他試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器與設(shè)備：ZDP-A2160A型曲線控制恒溫培養(yǎng)箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；5430R低溫高速離心機(jī)、真空離心濃縮儀(德國Eppendordf公司)；Triple TOF 6600 +質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)；Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀(美國Agilent公司)。

1.2 方法

1.2.1 腐敗希瓦氏菌體的制備 取腐敗希瓦氏菌株，按照中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供的菌種說明書進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后的菌懸液用生理鹽水洗滌3次，每次均在4 ℃下以4 000 r/min離心10 min，收集菌體備用。

1.2.2 腐敗希瓦氏菌刺激菲律賓蛤仔試驗(yàn) 將菌體用生理鹽水懸溶，調(diào)節(jié)其OD600 nm分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5，制成不同濃度的菌懸液，分別標(biāo)記為s-0.5、s-1.0、s-1.5、s-2.0、s-2.5。將暫養(yǎng)1 d的菲律賓蛤仔(體質(zhì)量8 g±1 g)分為7組，每組25只，分別放入盛有300 mL、(22±3)℃海水的潔凈搪瓷托盤(20 cm×25 cm×4.5 cm)內(nèi)。第1組不做任何處理作為空白組，第2～6組分別用1 mL無菌注射器向每只菲律賓蛤仔足肌中注射100 μL s-0.5、s-1.0、s-1.5、s-2.0、s-2.5的菌懸液，第7組海水中加入2.5 mL S-1.0菌懸液并記為浸泡組，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。在海水中培養(yǎng)12、24、36 h時(shí)，分別收集每組的海水，4 ℃下以9 000 r/min離心15 min，上清液用80%飽和度的硫酸銨鹽析12 h，相同條件下再離心，取沉淀用去離子水溶解并透析、凍干，得到MCL-T凍干粉。試驗(yàn)過程中觀察每組菲律賓蛤仔的死亡情況，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)測定每組MCL-T凍干粉的質(zhì)量。

按佟長青等[18]的方法檢測各組MCL-T凍干粉對無菌綿羊血細(xì)胞的凝集活性。

1.2.3 MCL-T對腐敗希瓦氏菌的抑制作用 取腐敗希瓦氏菌株，按照菌種說明書進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h后用無菌TSB培養(yǎng)液稀釋1 000倍，混勻后分裝12個(gè)錐形瓶中，分別加入不同量的MCL-T凍干粉，使其終濃度分別為0、0.01、0.1、1.0 mg/mL，相同培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，測定630 nm波長下各組的吸光度，檢測MCL-T對腐敗希瓦氏菌生長抑制情況。

1.2.4 MCL-T-HRP固相吸附試驗(yàn) 腐敗希瓦氏菌外膜蛋白(outer membrane proteins, OMP)的制備與包被酶標(biāo)板，以及MCL-T-HRP酶聯(lián)物的制備參考文獻(xiàn)[22-25]中的方法。

分別取稀釋100、200、400、800、1 600倍的MCL-T-HRP酶聯(lián)物稀釋液(對應(yīng)終濃度分別為55.56、27.78、13.89、6.94、3.47 μg/mL)各100 μL，加入包被后酶標(biāo)板中，4 ℃過夜。用PBS洗液洗滌3次后，再加入100 μL新配制的0.4 mg/mL鄰苯二胺(用pH 5.0的磷酸-檸檬酸配制)和15 μL H2O2溶液，于37 ℃下孵育10 min后，立即加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，測定492 nm下的吸光度[22-24]?？瞻滓訠SA代替腐敗希瓦氏菌OMP。試驗(yàn)設(shè)置 3個(gè)平行，測定MCL-T與腐敗希瓦氏菌OMP的結(jié)合情況。

1.2.5 pH對MCL-T-HRP結(jié)合腐敗希瓦氏菌OMP的影響 將包被后酶標(biāo)板各孔內(nèi)分別加入90 μL 0.05 mol/L的 HAc-NaAc(pH 5.0)、NaH2PO4-Na2HPO4(pH 6.0)、NaH2PO4-Na2HPO4(pH 7.0)、Tris-HCl(pH 8.0)、Gly-NaOH溶液(pH 9.0)，然后再加入90 μL MCL-T-HRP，4 ℃下過夜。用PBS洗液洗滌3次，余下操作同固相吸附測試，考察不同pH條件下，MCL-T與腐敗希瓦氏菌OMP的結(jié)合情況。

1.2.6 蛋白質(zhì)組學(xué)分析樣品的制備 將“1.2.3節(jié)”中測定吸光度后的0 mg/mL MCL-T組標(biāo)記為C組，1.0 mg/mL MCL-T組標(biāo)記為L組，離心，收集菌體，用生理鹽水洗滌3次后，以SDT裂解液(40 g/L SDS, 100 mmol/L Tris/HCl，1 mmol/L DTT，pH 7.6)在沸水浴下裂解10 min，超聲破碎細(xì)胞后離心，收集上清液，即為蛋白質(zhì)組樣品。

1.2.7 SDS-PAGE電泳 將蛋白質(zhì)組樣品與上樣緩沖液混合后進(jìn)行沸水浴5 min，將離心10 min(14 000g)后的上清液進(jìn)行SDS-PAGE。

1.2.8 樣品酶解及酶解產(chǎn)物的LC-MS/MS鑒定 根據(jù)翟興月等[25]的方法對L組和C組蛋白質(zhì)組樣品進(jìn)行胰蛋白酶酶解，獲得酶解液。取2 μg酶解產(chǎn)物(OD280 nm定量)進(jìn)行LC-MS/MS分析[25]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將LC-MS/MS原始文件導(dǎo)入Maxquant軟件1.3.0.5中進(jìn)行查庫和LFQ非標(biāo)記定量分析，數(shù)據(jù)庫為(uniprot_shewalla_126111_20161009.fasta)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行組間多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗希瓦氏菌對菲律賓蛤仔產(chǎn)生凝集素的影響

將不同濃度的腐敗希瓦氏菌注射入菲律賓蛤仔體內(nèi)后，各組在海水中培養(yǎng)12、24、36 h后，蛤仔的死亡情況及養(yǎng)殖海水中收集的MCL-T凍干粉量如表1所示，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長，各組菲律賓蛤仔死亡率均明顯上升，且在第36 h時(shí)死亡率為87%～100%，同時(shí)，從各組海水中收集的MCL-T凍干粉量也明顯增加，表明菲律賓蛤仔在養(yǎng)殖過程中特別是死亡過程中分泌到體外的物質(zhì)量增加。

表1 菲律賓蛤仔死亡率及養(yǎng)殖海水中MCL-T凍干粉量

對各組提取的MCL-T凍干粉進(jìn)行凝集活性檢測，結(jié)果顯示，隨著菲律賓蛤仔死亡率的增加，MCL-T凝集活性也略有增強(qiáng)，且S-1.0組凝集活性大于其他各組。

2.2 MCL-T的抑菌作用

從表2可見，低濃度(0.01 mg/mL)MCL-T對腐敗希瓦氏菌的生長具有一定程度的抑制作用，但不顯著(P>0.05)，當(dāng)MCL-T在培養(yǎng)液中濃度達(dá)到0.1 mg/mL以上時(shí)，其抑制作用顯著增強(qiáng)(P<0.05)。在試驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，含有高濃度MCL-T的培養(yǎng)液中，菌體量較少，且有部分團(tuán)狀物出現(xiàn)，但經(jīng)劇烈振蕩后，可以使團(tuán)塊分散。

表2 MCL-T對腐敗希瓦氏菌的抑制作用

2.3 MCL-T與腐敗希瓦氏菌外膜蛋白的相互作用

將腐敗希瓦氏菌OMP與不同濃度MCL-T-HRP溶液在酶標(biāo)板上的結(jié)合情況進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1(a)所示，隨著MCL-T濃度的增加，MCL-T與OMP結(jié)合的量也隨之增加，表明兩者結(jié)合具有濃度依賴關(guān)系。pH對MCL-T與OMP結(jié)合的影響如圖1(b)所示，當(dāng)pH為6時(shí)，MCL-T結(jié)合OMP的量最高，之后隨著pH的升高，MCL-T與OMP結(jié)合能力逐步下降，表明MCL-T與OMP的結(jié)合受pH的影響。

圖1 MCL-T結(jié)合腐敗希瓦氏菌的膜蛋白固相吸附測定

2.4 差異蛋白質(zhì)表達(dá)分析

通過SDS-PAGE對L和C組蛋白質(zhì)表達(dá)平行性進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，各樣品條帶分離清晰，樣品組內(nèi)平行性好(表2)，表明蛋白質(zhì)提取效果理想，可以繼續(xù)用酶解產(chǎn)物質(zhì)譜驗(yàn)證其平行性。蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜檢測結(jié)果顯示，各組樣品酶解和質(zhì)譜鑒定效果理想(圖3)，可用于蛋白質(zhì)組分析。

圖3 腐敗希瓦氏菌酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜圖

蛋白質(zhì)定量分析結(jié)果表明，C組和L組鑒定得到蛋白質(zhì)212個(gè)，其中，74個(gè)為差異表達(dá)蛋白質(zhì)(平均蛋白質(zhì)表達(dá)量之比≥2.0或≤0.5，且t檢驗(yàn)中P≤0.05)。對這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行GO(gene ontology)功能注釋(2水平)，包括：70個(gè)參與代謝過程、69個(gè)參與細(xì)胞過程、19個(gè)參與單組織過程、16個(gè)參與生理調(diào)節(jié)、7個(gè)參與定位、6個(gè)參與應(yīng)激響應(yīng)等10個(gè)生物過程；63個(gè)具有催化活性、59個(gè)具有結(jié)合功能、4個(gè)具有轉(zhuǎn)運(yùn)活性等6種分子功能；55個(gè)位于細(xì)胞、22個(gè)位于大分子復(fù)合物、9個(gè)位于細(xì)胞器、6個(gè)位于膜上等6種細(xì)胞組分(表3)。以上結(jié)果表明，MCL-T加入培養(yǎng)基中與腐敗希瓦氏菌共培養(yǎng)后，導(dǎo)致腐敗希瓦氏菌中響應(yīng)外界信號(hào)的蛋白質(zhì)表達(dá)量出現(xiàn)顯著變化，主要涉及細(xì)胞及大分子復(fù)合物中的具有催化活性和結(jié)合作用的蛋白質(zhì)參與代謝過程和細(xì)胞過程。

表3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)GO功能注釋

M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)；C1、C2和C3—C組3個(gè)平行樣品；L1、L2和L3—L組3個(gè)平行樣品。

通過對74個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行代謝通路分析，至少有2個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)參與的代謝通路(圖4)包括碳代謝、丙酮酸代謝、氨基酸生物合成、檸檬酸循環(huán)、丙酸代謝、糖酵解/糖異生、氨基酰-tRNA生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝等。參與丙酮酸代謝、檸檬酸循環(huán)、氨基酸生物合成、氨基酰-tRNA生物合成的差異表達(dá)蛋白質(zhì)如表4所示，13個(gè)參與丙酮酸代謝途徑、12個(gè)參與檸檬酸循環(huán)、9個(gè)參與氨基酰-tRNA生物合成途徑的差異表達(dá)蛋白質(zhì)均下調(diào)；參與氨基酸生物合成途徑的差異表達(dá)蛋白質(zhì)中有2個(gè)上調(diào)、10個(gè)下調(diào)，這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)分別直接或間接影響著組氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)和丙氨酸(Ala)等的生物合成。氨基酸合成、氨酰-tRNA合成與蛋白質(zhì)翻譯相關(guān)聯(lián)[28]。表明MCL-T干擾了腐敗希瓦氏菌的氨基酸代謝網(wǎng)絡(luò)。此外，磷酸甘油酸激酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脫氫酶E1組分、二氫硫辛酸脫氫酶、烏頭酸水合酶、α-酮戊二酸脫氫酶E1組分、琥珀酰-CoA合成酶α亞基及蘋果酸脫氫酶也處于碳代謝途徑中，其表達(dá)量也顯著下調(diào)。表明MCL-T是通過干擾腐敗希瓦氏菌的氨基酸合成、抑制丙酮酸代謝途徑和檸檬酸循環(huán)途徑等從而實(shí)現(xiàn)抑菌作用。

表4 參與丙酮酸代謝、檸檬酸循環(huán)、氨基酸生物合成和氨酰-tRNA生物合成的差異表達(dá)蛋白質(zhì)

圖4 至少2個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)參與的代謝通路

3 討論

3.1 菲律賓蛤仔產(chǎn)生凝集素的時(shí)間

凝集素是無脊椎動(dòng)物的天然免疫因子，其在不同生理狀態(tài)時(shí)體內(nèi)存在的數(shù)量有較大差異。Zheng等[29]研究白斑綜合征病毒侵染對蝦48 h時(shí)發(fā)現(xiàn)，對蝦C型凝集素CTL在肝胰腺中顯著表達(dá)，但以副溶血性弧菌侵染則未出現(xiàn)此現(xiàn)象。Xing等[30]研究櫛孔扇貝時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以鰻弧菌感染12 h時(shí)，櫛孔扇貝血細(xì)胞中的CTL表達(dá)量最高。Liang等[31]研究Vibrioparahaemolytics感染Onchidiumreevesii時(shí)發(fā)現(xiàn)，其肝胰腺和神經(jīng)節(jié)中CTL基因表達(dá)量從2 h時(shí)開始輕微上調(diào)，且在12 h時(shí)達(dá)最大表達(dá)量。此外，Li等[32]研究發(fā)現(xiàn)，菲律賓蛤仔受低溫脅迫也可使其體內(nèi)產(chǎn)生較多的CTL。本研究中發(fā)現(xiàn)，菲律賓蛤仔在實(shí)驗(yàn)室自然培育過程中，因受環(huán)境影響而逐漸死亡，并在這一過程中產(chǎn)生了凝集素。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在有適量腐敗希瓦氏菌刺激時(shí)，凝集素產(chǎn)量有增加趨勢，這一結(jié)果與上述研究結(jié)果相似。

3.2 菲律賓蛤仔凝集素的抑菌作用

凝集素表面具有糖結(jié)合位點(diǎn)，不同凝集素往往具有不同糖特異性，從而具有抑制不同微生物的作用。Zhang等[33]研究發(fā)現(xiàn)，菲律賓蛤仔肝胰腺中存在有唾液酸特異性凝集素Sabl，當(dāng)蛤仔受鰻弧菌侵染3 h后，該凝集素mRNA顯著表達(dá)，但敲除該基因的蛤仔受鰻弧菌侵染后的存活率下降。Li等[34]研究發(fā)現(xiàn)，菲律賓蛤仔唾液酸特異凝集素Sabl-1具有凝集金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、鰻弧菌和哈維氏弧菌的作用，能顯著抑制大腸桿菌生物膜的形成并抑制其生長。凝集素抑菌作用的關(guān)鍵一步，是與之結(jié)合，因此，明確其與細(xì)菌結(jié)合位點(diǎn)的特性，對于進(jìn)一步研究其抑菌機(jī)制具有重要作用。本研究中，MCL-T抑制腐敗希瓦氏菌生長，且MCL-T可以結(jié)合OMP，MCL-T與腐敗希瓦氏菌共同孵育后，MCL-T結(jié)合腐敗希瓦氏菌表面后進(jìn)而抑制菌的生長。

3.3 腐敗希瓦氏菌受抑制前后代謝酶表達(dá)量的變化

細(xì)菌分解代謝環(huán)境中的碳源、氮源構(gòu)建其自身物質(zhì)過程中需要大量的代謝酶，包括丙酮酸代謝、檸檬酸循環(huán)、氨基酸生物合成、氨基酰-tRNA生物合成等途徑的多種酶。已有許多研究表明，抑菌劑起作用時(shí)會(huì)引起細(xì)菌內(nèi)多種酶發(fā)生變化[35]。本研究中，腐敗希瓦氏菌受菲律賓蛤仔凝集素作用前后部分酶的表達(dá)量出現(xiàn)了顯著變化，其中，包括磷酸甘油酸激酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脫氫酶復(fù)合物、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、氨基酸轉(zhuǎn)氨酶、Thr-tRNA合成酶、Asn-tRNA合成酶、Phe-tRNA合成酶、His-tRNA合成酶、Cys-tRNA合成酶、Phe-tRNA合成酶、Asp-tRNA合成酶和Met-tRNA甲酰基轉(zhuǎn)移酶等，這些酶參與了腐敗希瓦氏菌多種代謝途徑。在厭氧條件下，糖主要通過糖酵解途徑中的1,3-二磷酸甘油酸和磷酸烯醇式丙酮酸分別轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸甘油酸和丙酮酸的過程中產(chǎn)生ATP，催化這兩個(gè)過程的是磷酸甘油酸激酶和丙酮酸激酶。本研究中，這兩種酶在腐敗希瓦氏菌中的表達(dá)量均顯著下調(diào)，表明其在厭氧條件下通過糖代謝，產(chǎn)生ATP受到抑制。丙酮酸脫氫酶復(fù)合物是催化丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴?CoA的關(guān)鍵酶，乙酰-CoA是生物體中脂肪酸從頭合成的必要原料，其量的減少影響生物膜的生成，進(jìn)而影響生物體的生長。細(xì)菌細(xì)胞壁中含有肽聚糖，其中含有大量的甘氨酸殘基。絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶催化絲氨酸與甘氨酸的相互轉(zhuǎn)變，當(dāng)細(xì)菌中甘氨酸含量不足時(shí)，會(huì)抑制細(xì)胞壁肽聚糖的生成，使細(xì)菌細(xì)胞不完整，導(dǎo)致細(xì)菌易受環(huán)境不利因素影響并致其死亡。氨基酸轉(zhuǎn)氨酶是多種酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)氨基酸的催化酶，氨酰-tRNA合成酶是催化蛋白質(zhì)生物合成過程中相應(yīng)氨酰-tRNA合成的催化劑，Met-tRNA甲酰基轉(zhuǎn)移酶是催化Met-tRNA轉(zhuǎn)變?yōu)榻^大多數(shù)蛋白質(zhì)生物合成所需要的起始肽鏈N-末端原料甲酰-甲硫氨酰-tRNA，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成原料——氨基酸、氨酰-tRNA、甲酰-Met-tRNA合成受抑制時(shí)，細(xì)菌因蛋白質(zhì)缺失而停止生長直到死亡。這些結(jié)果表明，MCL-T改變了腐敗希瓦氏菌基礎(chǔ)代謝水平，從而使得腐敗希瓦氏菌生長繁殖受到影響。這一結(jié)果與Pang等[37]、Zhang等[38]研究中得出的微生物受到不利因素影響會(huì)改變其基礎(chǔ)代謝水平的結(jié)論一致。

4 結(jié)論

1)MCL-T具有抑制腐敗希瓦氏菌的作用。MCL-T結(jié)合腐敗希瓦氏菌外膜蛋白，是實(shí)現(xiàn)抑制作用的第一步，且MCL-T與腐敗希瓦氏菌外膜蛋白的結(jié)合具有濃度依賴性。

2)MCL-T作用于腐敗希瓦氏菌后，參與代謝途徑的部分酶差異表達(dá)，包括參與氨基酸生物合成途徑的磷酸核酶焦磷酸激酶、烯醇化酶的表達(dá)量上調(diào)，參與丙酮酸代謝途徑、檸檬酸循環(huán)途徑、氨基酰-tRNA生物合成途徑、碳代謝途徑的蛋白質(zhì)表達(dá)量均下調(diào)。